Name: בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד אקסוזומים מרקמת הטחול בעכבר באמצעות עיכול קולגנאז ואולטרצנטריפוגה. שיטה זו שומרת על שלמות ממברנת התאים ומאפשרת מחקר מתקדם במחלות לב וכלי דם ובתחום האימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הדגימות נלקחו מעכברים, עם אישור אתי שניתן על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית גואנגדונג. תיאורים מפורטים של חומרים, ציוד ותוכנות המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. פרטי ההכנה לפני השאיבה מתוארים באיור 1, בעוד שתהליך המיצוי וההעשרה של הטחול-אקסו מתואר באיור 2.
1. הכנה
<ol>
	<li>קירור מראש של צנטריפוגות במהירות גבוהה ובמהירות גבוהה במיוחד ל -4 ° C והגדר את הטמפרטורה של שייקר שולחני ל -37 ° C.</li>
	<li>הכינו צלחות תרבית תאים (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 מ"מ), צינורות צנטריפוגות סטריליות בנפח 50 מ"ל, קרח ומסננת תאים סטרילית (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 מיקרומטר) כפי שמוצג באיור 1A, B.</li>
	<li>יש לעקר מספריים ומלקחיים באמצעות תרסיס 75% אלכוהול, ולאחר מכן לבצע עיקור בטמפרטורה גבוהה. הכלים האלה מוצגים באיור 1C.</li>
	<li>הניחו את רקמת הטחול בצלחת פטרי סטרילית <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">בקוטר 100 מ"מ על קרח, ושטפו את הדם שעל פני השטח עם מי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS). יבש את רקמות הטחול עם גזה סטרילית ולשקול אותם לאחר ייבוש. הערה: אם הרקמה קפואה, הפשירו אותה בצלחת במשך 15 דקות על קרח לפני שתמשיכו.</li>
	<li>לחות מסננת התא (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 מיקרומטר) על ידי הטלת 1 מ"ל של PBS סטרילי לתוך המסננת באמצעות פיפט העברה סטרילי.</li>
	<li>מכינים את מאגר העיכול (0.1% סוג I collagenase) באמצעות 1x PBS עם מערבל מערבולת. הערה: יש להשתמש ב-10 מ"ל של חיץ עיכול עבור כל 100 מ"ג של רקמת טחול. ריכוז הקולגנאז נבחר במחקר זה על סמך הוראות המוצר. עבור סוגי רקמות אחרים, ייתכן שהחוקרים יצטרכו להתאים פרמטרים אלה בהתבסס על צפיפות הרקמה והרכבה. ניסויים מקדימים עם ריכוזים משתנים וזמני עיכול מומלצים כדי לקבוע את התנאים האופטימליים עבור כל סוג רקמה.</li>
</ol>
2. עיכול רקמות
<ol>
	<li>קוצצים את הרקמה לחתיכות קטנות ואחידות בעזרת מספריים בצלחת תרבית על קרח (איור 3A) ומעבירים לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל בעזרת צינור העברה סטרילי.</li>
	<li>הוסיפו חיץ עיכול לצינור בהתאם למשקל רקמת הטחול כפי שצוין לעיל (איור 3B), ואז נערו את הצינור בזווית של 45° על שייקר אופקי ב-37°C. עקוב אחר התקדמות העיכול ועצור את העיכול כאשר גושי רקמות התפזרו, ורובם איבדו את צורתם. זמן העיכול צריך להשתנות בין רקמות. בתנאי הניסוי במחקר זה, זמן העיכול הוא כ -30 דקות.</li>
	<li>העבירו את התערובת המעוכלת למסננת תאים (Ф70 מיקרומטר) בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר פסולת רקמות סיבית וגדולה יותר. הערה: יש להשלים את הסינון מיד לאחר העיכול.</li>
	<li>אספו את התסנין בצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל.</li>
</ol>
3. בידוד אקסוזום על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית
<ol>
	<li>צנטריפוגה מסננת ב 500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. גלולה שמכילה תאים שיורית, פסולת תאים וגרעינים נראית אחרי צנטריפוגה, כפי שמוצג באיור 3C.</li>
	<li>העבר את supernatant לצינור חדש צנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. גלולה שמכילה גופים אפופטוטיים ומיקרוזומים נראית אחרי צנטריפוגה, כפי שמוצג באיור 3D.</li>
	<li>העבר את הסופרנאטנט לצינור וצנטריפוגה חדשים ב 10,000 x גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C. ניתן לראות גלולות המכילות מיקרו-שלפוחיות וקרום פלזמה לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3E.</li>
	<li>אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנאטנט שנוצר ב 120,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C. ניתן לראות גלולה בתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3F.</li>
	<li>השליכו את הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם PBS, ואולטרה-צנטריפוגה שוב ב-120,000 x גרם במשך שעתיים ב-4°C כדי לקבל אקסוזומים. ניתן לראות גלולה בתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3G.</li>
	<li>ממיסים את האקסוזומים המבודדים עם PBS סטרילי (200 מיקרוליטר לטחול) ומאחסנים את האקסוזומים המבודדים בצינור צנטריפוגה חדש של 2 מ"ל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>
4. אפיון אקסוזום במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
הערה: TEM שימש כדי לקבוע אם Exo שחולץ הציג מאפייני שלפוחית. דגימות אקסו המזוהות במיקרוסקופ אלקטרונים חייבות להיות דגימות טריות או מאוחסנות לזמן קצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לזמן קצר.
<ol>
	<li>תקן אקסוזומים (2-6 מיקרוגרם/μL) עם פרפורמלדהיד ברמת מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) של 2% ב-RT למשך שעתיים.</li>
	<li>מניחים 10 מיקרוליטר של תמיסה אקסוזום על רשת נחושת, דוגרים ב-RT למשך 10 דקות, שוטפים במים מזוקקים סטריליים ומכסים את עודפי הנוזל בנייר סופג.</li>
	<li>מכתימים את רשת הנחושת עם 2% אורניל אצטט למשך דקה אחת, מכסים את עודפי הנוזל בנייר פילטר ומייבשים תחת מנורת ליבון למשך 2 דקות.</li>
	<li>צפו בדגימה המוכנה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת ב 80 קילו וולט.</li>
</ol>
5. התפלגות גודל ומדידת ריכוז חלקיקים של אקסוזומים
<ol>
	<li>טען את חלקיקי הפוליסטירן הסטנדרטיים (250 ננומטר) לציטומטר זרימת ננו.</li>
	<li>מדוד את ריכוז החלבון של דגימות Exo באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. יש לדלל את דגימת Exo עם PBS בהתאם לתוצאות בדיקת חלבון BCA (לדלל את האקסוזומים ל-1-10 ננוגרם/μL), ולאחר מכן לטעון את דגימות Exo לננו-זרימה כדי למדוד את עוצמת פיזור הצד (SSI).</li>
	<li>חישוב ריכוז Exo לפי היחס בין SSI לריכוז החלקיקים בננו-חלקיקי פוליסטירן סטנדרטיים. הערה: עבור מדידת גודל, עקומה סטנדרטית נוצרת על ידי טעינת ננו-חלקיקי סיליקה סטנדרטיים עם גדלי שיפוע (68 ננומטר, 91 ננומטר, 113 ננומטר, 155 ננומטר) לציטומטר זרימת ננו. הטעינה של מדגם Exo עוקבת אחר כך. התפלגות הגודל של אקסו חושבה על פי התרופה הסטנדרטית.</li>
</ol>
6. ליזה ואישור אימונובלוט של חלבונים אקסוזום
<ol>
	<li>הוסף 100 μL של חיץ ליזה של בדיקת משקעים חיסוניים ברדיו (RIPA) לכדורית האקזוזום לצורך ניתוח חלבונים.</li>
	<li>מערבולת במרץ, מכסה עם פאראפילם, רוק במשך 20 דקות ב- RT, ואז מערבולת שוב.</li>
	<li>צנטריפוגה קצרה ב 1000 x גרם עבור 30-60 שניות לאסוף את הדגימה, להעביר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל, ולאחסן ב -20 ° C עד -80 ° C עד הניתוח.</li>
	<li>עבור אימונובלוט, יש לערבב דגימות עם מאגר העמסה 5x כדי להשיג ריכוז של 1x ולהתכונן לאלקטרופורזה בג'ל.</li>
	<li>אם רוצים בקרות הומוגניות של כל הרקמה, השתמשו בחיץ ליזה חזק עם מעכב פרוטאז כדי ליזה את הרקמה, כמפורט לעיל. לאחר מכן, צנטריפוגו את הדגימות במהירות של 10,000 x גרם למשך 10 דקות והשליכו את המטריצה החוץ-תאית הנותרת, תאים שלמים או פסולת תאית שלמה.</li>
	<li>מרתיחים את מאגר הדגימה המכיל אקסוזומים או הומוגנט רקמות ב 95 ° C למשך 5-10 דקות. טען חלבון שווה לכל נתיב לתוך ג'ל SDS-PAGE 10%. עומס חלבון שווה של הומוגנט רקמה כבקרה.</li>
	<li>המשך עם אלקטרופורזה ג'ל תחת מתח של 80 V במשך כשעתיים באמצעות מאגר אלקטרופורזה קונבנציונאלי. בצע ניתוח כתמים מערביים כדי לאשר ביטוי חלבון אקסו בליזטים המטוהרים ולהשוות שפע אקסו יחסי בשברים.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>טכניקות זיקוק לבידוד אקסוזום המופק מטחול מורין

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Front Mol Biosci. 7, 33(2020).</li>
<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enrichment+method+for+small+extracellular+vesicles+derived+from+liver+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue.</a> J Vis Exp. (192), e64499(2023).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>Biologix Group Co., Ltd.ארה"ב</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD9</td><td>Cell Signaling Technology, Inc (CST), ארה"ב</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti GM130</td><td>Proteintech Group, Inc.סין&nbsp;</td><td>66662-1-LG</td><td></td></tr><tr><td>אנטי TSG101 נוגדן</td><td>Abcam Plc, בריטניה</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים</td><td>Wuxi NEST ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה</td><td>Wuxi NEST ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., ארה"ב</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td> <td>תרמוסטטי שולחנישנחאי bluepard מכשירים ושות', בע"מ, סין</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>מאגר אלקטרופורזה</td><td>ווהאן Servicebio Technology Co., Ltd., סין&nbsp;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA משופרת</td><td>שנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין&nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc., סין</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה פלואורסצנטית/כימילומינסנציה&nbsp;</td><td>גואנגג'ואו ביולייט ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP עז נגד עכבר IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.סין&nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP עז נגד ארנב IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.סין&nbsp;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות</td><td>מכשירים מולקולריים, ארה"ב</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>שנחאי&nbsp; רפואי&nbsp; מכשירים (קבוצה)&nbsp;Co., Ltd.,סין</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מיקרוסקופית</td><td>שנחאי&nbsp; רפואי&nbsp; מכשירים (קבוצה)&nbsp;Co., Ltd., סין</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר מדעי, ארה"ב</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עיניים</td><td>שנחאי&nbsp; רפואי&nbsp; מכשירים (קבוצה)&nbsp;Co., Ltd., סין</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עיניים</td><td>שנחאי&nbsp; רפואי&nbsp; מכשירים (קבוצה)&nbsp;Co., Ltd., סין&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 צנטריפוגה אולטרה-סינון</td><td>בקמן קולטר, ארה"ב</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה (חזק, ללא מעכבים)</td> <td>שנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין&nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>מעדניית סרגל</td><td>&nbsp; ייצור&nbsp; חברה, סין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE מאגר טעינה לדוגמא, 5x</td><td>שנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין&nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>העברת Pipet</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td><td>היטאצ'י, יפן</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>צינור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר, ארה"ב</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>מאגר העברה מערבית&nbsp;</td><td>ווהאן Servicebio טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין&nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

בידוד וטיהור של אקסוזומים שמקורם בטחול כדי לבודד אקסוזומים מרקמת הטחול של עכבר השתמשנו בשילוב של עיכול קולגן ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (איור 2). השלבים הראשונים כללו טיפול מקדים ברקמת הטחול כדי להסיר דם פני השטח, ולאחר מכן עיכול עם collagenase מסוג I. טיפול אנזימטי זה הקל על פירוק רכיבי המטריקס החוץ תאיים, ובכך שחרר את האקסוזומים תוך שמירה על שלמותם. לאחר העיכול, נעשה שימוש בסדרה של צעדי צנטריפוגה כדי להסיר ברצף פסולת תאית, גופים אפופטוטיים ובועיות גדולות יותר, שהגיעו לשיאם באולטרה-צנטריפוגה של הסופרנאטנט ב -120,000 x גרם כדי להניע את האקזוזומים. הליכי בידוד מאוחרים יותר הניבו כדוריות מסיסות PBS מועשרות באקסו שמקורו בטחול, כפי שניתן לראות באיור 3G.
תוצאות TEM המורפולוגיה של האקסוזומים המבודדים נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, שיטה סטנדרטית לחקר אפיון האקסוזומים. TEM משמש בדרך כלל כדי לאמת את נוכחותם של אקסוזומים, להעריך את איכות האקסוזומים ולצפות במורפולוגיה של אקסוזומים. תמונות TEM (איור 4A) חשפו נוכחות של שלפוחיות בצורת גביע, אשר אופייניות לאקזוזומים. שלפוחיות אלה הציגו מבנה דו-שכבתי שומני ברור, המאשר את הבידוד המוצלח של אקסוזומים מרקמת הטחול.
התפלגות גודל של טחול-אקסו התפלגות הגודל והריכוז של האקסוזומים נקבעו באמצעות ציטומטר ננו-זרימה. התוצאות (איור 4B) הצביעו על כך שקוטר האקסוזומים המבודדים נע בין 30 ל-150 ננומטר, עם ריכוז שיא של כ-60 ננומטר. קוטר החלקיקים המבודדים היה דומיננטי בין 50-80 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים ממוצע של 4.6 x 109 חלקיקים למ"ל. טווח גדלים זה עולה בקנה אחד עם מאפיינים שדווחו בעבר של אקסוזומים, מה שמאמת עוד יותר את פרוטוקול הבידוד.
ניתוח כתמים מערביים כדי לאשר את נוכחותם של סמנים אקסוזומליים, ביצענו ניתוח כתם מערבי. הסמנים האקזוזומליים TSG101 ו-CD9 זוהו בדגימות הטחול-אקסו, ואילו GM130, חלבון מטריצת גולג'י המשמש כביקורת שלילית, לא זוהה (איור 4C). לשם השוואה, החלבון של סמנים אלה בא לידי ביטוי ברקמות הטחול של העכבר (Spleen-T). זה מצביע על הטוהר הגבוה של האקסוזומים המבודדים, שכן הם היו נטולי מזהמים תאיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
איור 1: הכנת אספקה. (A) צינורות צנטריפוגות בנפח 50 מ"ל, צלחות תרבית, קרח וכלי ניתוח הונחו בארון בטיחות ביולוגית. (B) מסננת תאים סטרילית (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 מיקרומטר). (ג) כלי ניתוח מעוקרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
איור 2: הליך בידוד טחול-אקסו. הכן רקמת טחול לחתוך אותו לחתיכות קטנות PBS קר, ואחריו עיכול עם סוג I collagenase וצנטריפוגה כפי שצוין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
איור 3: תמונות מייצגות של בידוד טחול-אקסו. (A) גושי טחול קטנים המוכנים לעיכול הבא. (B) גושי רקמת הטחול עם חיץ העיכול. (C) כדורים לאחר 500 x גרם צנטריפוגה. (D) כדורים לאחר צנטריפוגה של 3,000 x גרם . (E) כדוריות לאחר צנטריפוגה של 10,000 x גרם . (F) כדורים לאחר צנטריפוגה של 120,000 x גרם . (G) כדורי אקסוזום לאחר צנטריפוגה של 120,000 x גרם . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
איור 4: זיהוי של טחול-אקסו. (A) תוצאות TEM המציגות חלקיקים מבודדים כשלפוחיות קרומיות עגולות או סגלגלות עם מורפולוגיה בצורת גביע. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר ו- 50 ננומטר, בהתאמה. (B) ניתוח התפלגות גודל על ידי Flow Nano Analyzer הראה כי הקוטר של Spleen-Exo נע באופן דומיננטי בין 50 ננומטר ל 80 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים ממוצע של 4.6 × 109 חלקיקים / מ"ל. (C) ניתוח כתמים מערביים המראה ביטוי של חלבוני סמן ספציפיים לאקזוזום (TSG101 ו-CD9) בטחול-אקסו, עם ביטוי שלילי של GM130. סמנים אלה זוהו בדגימות חלבון שהופקו מטחול עכבר (קבוצת Spleen-T). הוצגו תמונות הכתם המערבי המייצג (n = 6 רקמות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

isolation-characterization-exosomes-derived-from-mouse-spleen

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

וידאו זה מתאר פשוטים, חוסך זמן טכניקה ניתוק אוטומטי רקמות באמצעות Dissociator gentleMACS להכין תא בודד השעיות של splenocytes העכבר.

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

במאמר זה אנו מדגימים את הבידוד של Murine ריאות תושב בתאי גזע mesenchymal (ריאות MSC), הרחבה שלהם, אפיון וניתוח של מאפייני המערכת החיסונית.

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

מתוארות טכניקות המתארות הליך שיפוע להפרדת אקסוזומים מחלקיקי נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). הליך זה שימש לבידוד אקסוזומים הרחק מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית מאנשים נגועים ב-HIV. האקסוזומים המבודדים נותחו לתכולת ציטוקין/כימוקין.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

נוזל המרה הוא מקור יקר לשלפוחיות חוץ-תאיות/אקסוזומים המכילים סמנים ביולוגיים בעלי פוטנציאל חשוב. פרוטוקול זה מייצג שיטה חזקה לבידוד אקסוזומים ממרה אנושית לניתוחים נוספים כולל פרופיל miRNA.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד תאים דנדריטים טחולים מאתר על ידי מיון מגנטי תא עוקבות המאמצת העברת לתוך תמים עכברים. המודל של תאים דנדריטים מופעל מלח גבוהה נבחר להסביר את ההליכים צעד אחר צעד של cytometry זרימה והעברת המאמצת.

בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

מחקר זה משתמש cytometry זרימה ושתי אסטרטגיות gating שונות על עכברים מבודדים perfused מוח choroid plexuses; פרוטוקול זה מזהה את תתי-הערכות העיקריות של תאי החיסון המאכלסות מבנה מוח זה.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח

למד פרוטוקול לבידוד אקסוזומים מרקמת הטחול בעכבר באמצעות עיכול קולגנאז ואולטרצנטריפוגה. שיטה זו שומרת על שלמות ממברנת התאים ומאפשרת מחקר מתקדם במחלות לב וכלי דם ובתחום האימונולוגיה.

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

גלה סרטונים נוספים