מידול הגליקוקליקס האנדותל לאחר כריתת ריאות בשבב נוזלי תלת מימדי - גישה לייצור מערכת איבר-על-שבב מבוססת כלי דם
16 בספטמבר 2025
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת איבר-על-שבב (OOC) שנועדה לחקות כריתת ריאות. מערכת זו חוקרת את המתאם הפוטנציאלי בין פגיעה בגליקוקליקס לסיבוכים לאחר כריתת ריאות.
מעבדת Mensah מתמקדת בחקר כלי הדם ומפתחת טכניקות חדשות לחקר הגליקוקליקס האנדותל ותפקידו במחלות כלי דם. ההתפתחויות האחרונות כוללות יצירת מודלים מתקדמים יותר במבחנה לחקר גליקוקליקס ומחקר אסטרטגיות טיפוליות להתמקדות בבריאות האנדותל גליקוקליקס ותיקון במחלות. אתגרי הניסוי כוללים מודלים לא שלמים במבחנה, שאינם מצליחים לשכפל במדויק גליקוקליקס בריא, כמו גם טכניקות כימות ומדידה קשות.
התרומה הנוכחית שלנו לתחום הרחיבה את ההבנה הנוכחית של הגליקוקליקס האנדותלי, במיוחד בתפקידו בגרורות סרטניות, התחדשות של גליקוקליקס פגום ואינטראקציות עם קולטנים על פני כלי הדם. השיטה שלנו מציגה שיטה זולה ויעילה ליצירת מערכות כלי דם של איבר על שבב המבטאות גליקוקליקס אנדותל אנדותל מפותח וביומימטי יותר בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות. כדי להתחיל, שקלו 10 חלקים בסיס אלסטומר סיליקון בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.
יוצקים חומר ריפוי חלק אחד לתוך הצינור המכיל את בסיס אלסטומר הסיליקון לנפח סופי של 30 מיליליטר. מערבבים היטב לקבלת תמיסה אחידה. כעת שפכו את התמיסה המעורבת היטב לתבניות, ולאחר מכן הכניסו את התבניות לתא ואקום כדי לנקות את ה-PDMS למשך 30 עד 60 דקות או עד שלא יישארו בועות.
הסר את ה-PDMS נטול הגז מתא הוואקום ואפשר לו להתרפא בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. חלץ את ה-PDMS הנרפא מתבנית ה-PLA. לאחר מכן הניחו שתי חתיכות סרט דו צדדי בכל צלחת תרבית תאים.
לאחר מכן, מקם כל כלי דם PDMS חצי על גבי הסרט בצלחת תרבית תאים משלו. הניחו כמה טיפות של 30 מיקרוליטר של פיברונקטין לאורך כלי הדם של PDMS באמצעות מיקרופיפטה. הטה את ה-PDMS לפי הצורך, והשתמש בקצה פיפטה כדי לצפות את המשטח באופן שווה.
לאחר דגירה של 30 דקות, יש לשאוב את תמיסת הפיברונקטין מה-PDMS. לאחר מכן הניחו לחלקים להתייבש באוויר בתוך הארון. הנח תקעים מודפסים בתלת מימד בכל קצה של חצאי כלי הדם של PDMS כדי למנוע דליפת מתלה תאים, באמצעות שני תקעים לכל יחידה.
בעזרת מיקרופיפטה, זרעו 300 מיקרוליטר של תרחיף תאי HLMVEC לכל חתיכת PDMS ודגרו. לאחר מכן החזירו את החצאים לארון והוציאו את ארבעת התקעים. הוסף מדיום תרבית HLMVEC כדי להטביע את חצאי כלי הדם של PDMS, ודגירה שוב למשך שש עד 10 שעות.
כעת שאפו את אמצעי ה- HLMVEC מצלחת הפטרי המכילה את חצאי כלי הדם. הנח כל חצי PDMS לתוך גושי הפוליקרבונט, והבטיח יישור נכון. מרחו איטום סיליקון על קצות כלי הדם PDMS.
הכנס צינור באורך סנטימטר לשני הקצוות של חתיכת ה-PDMS התחתונה. לאחר מכן הפוך את בלוק האקריליק העליון המכיל את חצי ה-PDMS העליון על בלוק האקריליק התחתון. הברג את הבלוקים האקריליים זה לזה, וודא שבלוק הברגה נמצא בתחתית.
חבר את הקצוות החופשיים של הצינור באמצעות תקעים מודפסים בתלת מימד. הסר פקק אחד והזריק בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית HLMVEC לתוך כלי הדם באמצעות מיקרופיפטה. הטה כדי להסיר בועות אוויר ולאחר מכן החלף את התקע.
הכניסו את השבב המורכב והרכיבים הסטריליים לארון הבטיחות הביולוגית. חבר את כל הצינורות והרכיב את מערכת הזרימה, וודא שצינור הכניסה מתחבר לתחתית מאגר המזרק כדי להקל על זרימת כוח הכבידה. כעת העבירו בעדינות את מערכת הזרימה עם מדיום HLMVEC.
השתמש בפיפטה סרולוגית של 50 מיליליטר. הזרקו 30 מיליליטר של מדיום לחלק העליון של מאגר המזרק, והפעילו את המשאבה הפריסטלטית במהירות נמוכה למילוי צינורות. שטפו כל חצי כלי דם PDMS ב-PBS למשך חמש דקות, והוסיפו מספיק תמיסה כדי לטבול את חלק כלי הדם במלואו.
סימולציית הנוזל הראתה מתח גזירה מוגבר משמעותית בהתפצלות כלי הדם במודל כריתת ריאות בהשוואה למודל הבקרה. מיקרוסקופיית ברייטפילד אישרה חיבור אחיד של תאי HLMVEC הן בתנאים סטטיים והן בזרימה ב-93.1 מיליליטר לדקה לאחר 24 שעות. הדמיה פלואורסצנטית של התפצלות הכניסה הראתה שכבות תאים שלמות ומפוזרות היטב הן במודלים של ביקורת והן במודלים של כריתת ריאות.
הדמיה מיד לאחר ההסתעפות השנייה חשפה אובדן תאים משמעותי הן במודל הביקורת והן במודל כריתת ריאות. התאים נותרו דבקים והראו צביעה עקבית באזור במורד הזרם של ההסתעפות השנייה בשני המודלים. גרעינים אחידים מוכתמים ב-DAPI במודלים של כלי הדם הצביעו על כך שהמפגש נשמר למרות החשיפה לזרימה.
ניסוי מודל בקרה מוקדם הביא לפיזור תאים לא אחיד עקב בועות אוויר שהוכנסו במהלך תחול המערכת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להקמה של מערכת איבר-על-שבב (OOC) המדמה כריתת ריאה (pneumonectomy). המערכת תוכננה כדי לבחון את המתאם בין פגיעה בגליקוקליקס לבין סיבוכים בעקבות כריתת ריאה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מחקר כלי דם
- גליקוקליקס אנדותליאלי
- טכנולוגיית איבר-על-שבב
רקע
- מעבדת Mensah מתמקדת במחקר כלי דם ובגליקוקליקס אנדותליאלי.
- אתגרים נוכחיים כוללים מודלים לא שלמים in vitro וקשיים בכימות.
- הבנת הגליקוקליקס היא קריטית לטיפול במחלות כלי דם.
- התפתחויות אחרונות שואפות לשפר מודלים in vitro למחקר הגליקוקליקס.
מטרת המחקר
- לבחון את תפקידו של הגליקוקליקס (glycocalyx) בבריאות כלי הדם.
- לפתח מודל מדויק יותר של איבר-על-שבב (organ-on-chip) למחקרי פנומונקטומיה (pneumonectomy).
- לבחון אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לבריאות הגליקוקליקס.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של מערכת איבר-על-שבב (organ-on-chip).
- שימוש באלסטומר סיליקון לפיתוח המודל.
- חקירה של פגיעה בגליקוקיאלייקס (glycocalyx).
- תיקוף ניסיוני של יעילות המודל.
תוצאות עיקריות
- מערכת ה-OOC שפותחה מדמה ביעילות פנומונקטומיה (כריתת ריאה).
- הממצאים מצביעים על קשר בין פגיעה בגליקוקליקס לבין סיבוכים ניתוחיים.
- המודל מדגים ייצוג משופר של הגליקוקליקס בהשוואה לטכניקות קונבנציונליות.
- התובנות שהושגו עשויות להנחות גישות טיפוליות עתידיות.
מסקנות
- מערכת איבר-על-שבב היא כלי בעל ערך לחקר תגובות כלי דם.
- הבנת הדינמיקה של הגליקוקליקס יכולה לשפר אסטרטגיות טיפוליות.
- מחקר זה תורם לתחום הרחב של הבנת מחלות כלי דם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
מידול של הגליקוקליקס האנדותליאלי לאחר פנומונקטומיה בשבב פלואידי תלת-ממדי נותן מענה לפער קריטי בביולוגיה וסקולרית על ידי מתן אפשרות לבחינה מדויקת של השפעות מאמץ הגזירה על התפקוד הוסקולרי. מערכת איבר-על-שבב זו מגבירה את הביטחון החזוי באישור מטרות בשלב מוקדם ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור סיבוכים וסקולריים בעקבות התערבויות כירורגיות. הגישה תומכת ברציפות תרגומית ממידול חישובי לוולידציה ניסויית, ומספקת מידע לקבלת החלטות בתיקי פיתוח ומחקר וסקולריים וריאתיים המותאמות לסיכון.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מכניסטית של תגובת הגליקוקליקס האנדותליאלי למאמץ גזירה שונה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת תגובות של מסלולים וסקולריים לאחר פנומונקטומיה.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות עבור אסטרטגיות לתיקון כלי דם וצמצום סיבוכים.
- משפר את רמת הביטחון החזוית עבור מחקרי תרגום (translational studies) בהמשך.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת כלי דם בתלת-ממד שעברה תיקוף לצורך סריקה רבבמיקה in vitro של תגובות אנדותליאליות.
- מסטנדרט את תנאי הבדיקה לכימות בריאות הגליקוקליקס תחת משטרי זרימה מבוקרים.
- מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה ניתנת להרחבה לצורך הערכת תרכובות המכוונות לשמירה על שלמות כלי הדם.
- מספק תוצאים כמותיים ואיכותיים לפיתוח בדיקות אסיי (assay) חסונות.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro למודלים וסקולריים רלוונטיים למחלה לצורך חקירה תרגומית של סממנים ביולוגיים.
- תומכת ברציפות משלב הסימולציה החישובית ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות וסקולריות.
- מספקת בסיס לקבלת החלטות מותאמות סיכון לקידום תרופיתים המכוונים לכלי דם.
- מספקת הפחתת סיכונים מבוססת מנגנונים עבור סיבוכים וסקולריים לאחר ניתוח.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
שיטה זו של איבר-על-שבב (organ-on-chip) משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך זיהוי מולקולת מובילה ועד למחקר פרה-קליני, ובכך מגשרת בין מידול חישובי לתיקוף ניסויי בביולוגיה וסקולרית.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בדיקת היפותזות לגבי השפעות של מאמץ גזירה על הגליקוקליקס האנדותליאלי ותפקוד כלי הדם.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת תוצרי צביעה אימונוהיסטוכימית ודימוי להשוואת בריאות ה-GCX בתנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תגובות וסקולריות in vitro לבין סיכון לסיבוכים פוסט-כירורגיים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת איבר-על-שבב (organ-on-chip) לשימוש חוזר עבור יישומים מגוונים במחקר וסקולרי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות כלי דם.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות כלי דם.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) טובות יותר וביעילות הון בצינורות פיתוח ומחקר של כלי דם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לטיפול בכלי דם ובריאות הריאות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של כלי דם, מיקרופלואידיקה ומידול חישובי.
- נדרשת גישה להדפסה בתלת-ממד, יציקת PDMS ותשתיות דימות מתקדמות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית להבטחת שחזור של הבדיקה והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודלים וסקולריות שונות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- כימות תקינות הגליקוקליקס עשוי להיות מוגבל בשל טכניקות הדימות והצביעה הנוכחיות.
