ניתוח אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות באמצעות פינצטה מגנטית של מולקולה אחת

שיטות של מולקולות בודדות שימשו לחקר אינטראקציה טלומרית בין חלבון לדנ”א. עם זאת, הכנת מבנים של מולקולה בודדת עם המוטיבים הטלומריים החוזרים על עצמם נותרה משימה מאתגרת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים לביטוי וטיהור חלבון TRF2, הכנת DNA טלומרי, הגדרת בדיקות מכניות של מולקולה בודדת וניתוח הנתונים המתקבלים.

כלים של מולקולה בודדת הם טכניקות רבות עוצמה לחקר אינטראקציות טלומריות בין חלבון לדנ”א. שיטות מכניות של מולקולה אחת, כגון פינצטה מגנטית, פינצטה אופטית ו-AFM שימשו לחקר עיוות DNA תלוי TRF2, חשיפת ערימה טורית בתיווך TRF2 של כרומטין טלומרי אנושי, וצפייה בנוכחות של קטליזה טלומראז בין יישומים אחרים. חקרנו אינטראקציות טלומריות בין דנ”א לחלבון באמצעות פינצטה מגנטית מולקולרית יחידה, שאפשרה מדידות מדויקות של שינויים בהארכה ומשכי הזמן של אינטראקציות חלבון-דנ”א תחת כוחות מופעלים.

ממדידות אלה הסקנו את קינטיקה הדיסוציאציה של קומפלקסים טלומריים של חלבוני דנ”א. יתר על כן, היווצרות לולאות בתוך קומפלקסים אלה נחשפה. מבנים רבים של חלבונים קושרי טלומרי בקומפלקס עם DNA נפתרו באמצעות cryo-EM, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו- NMR.

תובנות מבניות אלה קידמו את הבנתנו את יחסי הגומלין הטלומריים בין חלבון לדנ”א. כדי להמשיך לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות אלה, פיתחנו שיטה מכנית של מולקולה אחת במיוחד לחקר אינטראקציות חלבון-דנ”א טלומריות. כלים חד-מולקולתיים הם טכניקות רבות עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ”א בטלומרים.

שיטות אלה חשובות במיוחד עבור קונפורמציות טופולוגיות וניתוח הקינטיקה של קשר חלבון-דנ”א ודיסוציאציה.