30 באוגוסט 2024
פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.
שיטות של מולקולות בודדות שימשו לחקר אינטראקציה טלומרית בין חלבון לדנ"א. עם זאת, הכנת מבנים של מולקולה בודדת עם המוטיבים הטלומריים החוזרים על עצמם נותרה משימה מאתגרת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים לביטוי וטיהור חלבון TRF2, הכנת DNA טלומרי, הגדרת בדיקות מכניות של מולקולה בודדת וניתוח הנתונים המתקבלים.
כלים של מולקולה בודדת הם טכניקות רבות עוצמה לחקר אינטראקציות טלומריות בין חלבון לדנ"א. שיטות מכניות של מולקולה אחת, כגון פינצטה מגנטית, פינצטה אופטית ו-AFM שימשו לחקר עיוות DNA תלוי TRF2, חשיפת ערימה טורית בתיווך TRF2 של כרומטין טלומרי אנושי, וצפייה בנוכחות של קטליזה טלומראז בין יישומים אחרים. חקרנו אינטראקציות טלומריות בין דנ"א לחלבון באמצעות פינצטה מגנטית מולקולרית יחידה, שאפשרה מדידות מדויקות של שינויים בהארכה ומשכי הזמן של אינטראקציות חלבון-דנ"א תחת כוחות מופעלים.
ממדידות אלה הסקנו את קינטיקה הדיסוציאציה של קומפלקסים טלומריים של חלבוני דנ"א. יתר על כן, היווצרות לולאות בתוך קומפלקסים אלה נחשפה. מבנים רבים של חלבונים קושרי טלומרי בקומפלקס עם DNA נפתרו באמצעות cryo-EM, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו- NMR.
תובנות מבניות אלה קידמו את הבנתנו את יחסי הגומלין הטלומריים בין חלבון לדנ"א. כדי להמשיך לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות אלה, פיתחנו שיטה מכנית של מולקולה אחת במיוחד לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות. כלים חד-מולקולתיים הם טכניקות רבות עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בטלומרים.
שיטות אלה חשובות במיוחד עבור קונפורמציות טופולוגיות וניתוח הקינטיקה של קשר חלבון-דנ"א ודיסוציאציה.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במלקטים מגנטיים של מולקולה יחידה כדי לחקור את האינטראקציות בין חלבוני קישור DNA טלומריים TRF1 ו-TRF2 לבין טלומרים אנושיים. הוא מפרט את הכנת הטלומרים והחלבונים, ביצוע ניסויים ושיטות לאיסוף ונתונים וניתוח.
Single-molecule magnetic tweezers enable precise, quantitative interrogation of telomeric protein-DNA interactions, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early-stage oncology drug discovery. By resolving dissociation kinetics and loop formation of TRF1/TRF2 on full-length human telomeric DNA, this approach enhances predictive confidence at the intersection of discovery biology and translational research. The method supports portfolio decisions by clarifying the functional impact of candidate modulators on telomere maintenance mechanisms.
This single-molecule mechanical assay bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling hypothesis-driven interrogation of telomeric protein-DNA interactions.