אופטימיזציה של הכנת אנטיגן לבדיקת עיכוב המגלוטינציה של סרולוגיה של נגיף מחלת ניוקאסל

המחקר שלנו מתמקד באופטימיזציה של הכנת אנטיגן למבחני עיכוב המגלוטינציה. כדי לשפר את דיוק זיהוי הנוגדנים של NDV, אנו מספקים שיטה להכנה מהירה ומדויקת לתמיסת אנטיגן 4-HAU. בדיקת HI נותרה השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי נוגדנים NDV.

עם זאת, ניתן לשלב בבדיקת HI טכנולוגיות חדשות, כולל מערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים, פלטפורמות סרולוגיות בעלות תפוקה גבוהה וכלי הדמיה מתקדמים. הם מאפשרים ניתוח מהיר ומדויק יותר, במיוחד בעת טיפול בגדלי אצווה גדולים. הקמנו שיטה יעילה לזיהוי מדויק יותר של טיטר HA של תמיסת מלאי אנטיגן, בשילוב עם שיטת טיטרציה לאחור קפדנית ותהליך התאמה מוגדר היטב.

גישה זו מספקת שיטה מדויקת וממזערת משימות חישוביות, מגבירה את יעילות הבדיקה ואמינותה, ותורמת לשיפור המעקב והבקרה על מחלות באוכלוסיות העופות. תרחיף תאי הדם האדומים של התרנגולת והקריאה החזותית של תוצאות HA HI עדיין תורמים לשונות. המעבדה שלנו תתמקד בסטנדרטיזציה של מתלי ה-RBC ובחקר ראייה ממוחשבת או שיטות אחרות לדיגיטליזציה של תוצאות בדיקת HA HI, הפחתת הסובייקטיביות ושיפור העקביות.

כדי להתחיל, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת Alserver לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. אספו מיליליטר אחד של דם מווריד הכנף של כל אחת משלוש התרנגולות הלא מחוסנות. לאחר מכן, העבירו מיד את הדם שנאסף לתוך הצינור נוגד הקרישה וערבבו בעדינות את התוכן על ידי היפוך.

מלאו את הצינור ב-PBS סטרילי כדי להביא את הנפח הכולל ל-12 מיליליטר. מערבבים את התמיסה בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של הרכיבים. לאחר מכן, הכניסו את הצינור לצנטריפוגה המצוידת ברוטור אופקי וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט ואת שכבת תאי הדם הלבנים מהצינור. בעזרת פיפטה, פיפטה הפוכה מיליליטר אחד של כדור ה-RBC ל-99 מיליליטר של תמיסת PBS סטרילית להכנת תרחיף RBC של 1%. כדי להרכיב מחדש את האנטיגן הליופילי, הוסף שני מיליליטר של PBS סטרילי לאמפולה המכילה אותו.

נערו בעדינות את האמפולה כדי להמיס את התכולה לחלוטין והניחו לה לעמוד במשך שתיים-שלוש דקות כדי למזער את היווצרות הבועות. Aliquot שיחזר את התמיסה לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ואחסן אותה במקפיא המוגדר במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להתחיל, חלקו 40, 80, 120 ו-160 מיקרוליטר של PBS בהתאמה לארבע בארות סמוכות של צלחת מיקרוטיטר חד פעמית עם 96 בארות V-bottom.

הוסף 20 מיקרוליטר של האנטיגן המחודש לכל באר ופיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי ליצור דילול. לאחר מכן, סמן לוחית מיקרוטיטר חדשה בבירור לשלבים הבאים, והחלק 25 מיקרוליטר PBS לכל באר בשורות אחת עד חמש. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הניחו 25 מיקרוליטר מתמיסות האנטיגן המדוללות לבארות הראשונות של שורות אחת עד חמש.

פיפטה את התכולה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד. לאחר מכן, העבירו 25 מיקרוליטר מהבאר הראשונה של כל שורה לבאר השנייה, תוך ערבוב יסודי. השלך 25 מיקרוליטר מהתמיסה הסופית לאחר העמודה ה -11.

לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של PBS ו-1% תרחיף RBC עוף בהתאמה לכל באר, החל מהבארות המכילות את ריכוז האנטיגן הנמוך ביותר. הנח את צלחת המיקרוטיטר על שייקר המיקרופלייט כדי לערבב היטב. השאירו את הצלחת ללא הפרעה על הספסל בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות כדי לאפשר ל-RBCs בעמודה ה-12 להתיישב לחלוטין.

חשב את גורם הדילול להכנת תמיסת האנטיגן 4-HAU באמצעות הנוסחה המוצגת כאן. קבע את הנפח הכולל של תמיסת 4-HAU הדרושה ואת הנפחים הנדרשים של תמיסת מלאי האנטיגן ו-PBS באמצעות הנוסחה הנתונה. בעזרת פיפטה, העבירו את הנפח המחושב של PBS למיכל.

הוסף את הנפח המתאים של תמיסת מלאי האנטיגן וערבב היטב להכנת תמיסת האנטיגן 4-HAU. לאחר מכן, חלקו 25, 50, 75, 100, 125 ו-150 מיקרוליטר של PBS לשש בארות סמוכות של לוחית מיקרוטיטר. הוסף 25 מיקרוליטר מתמיסת האנטיגן 4-HAU לכל באר, ופיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להבטיח דילול נכון.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו 25 מיקרוליטר מכל תמיסת אנטיגן מדוללת מהשורה הראשונית לבארות של שורה אחרת. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר PBS לכל באר, ואחריהם 25 מיקרוליטר של תרחיף RBC עוף 1% בכל באר. הניחו את הצלחת על שייקר מיקרופלייט למשך כ-20 שניות כדי לערבב היטב את התוכן.

התבונן בזהירות בדפוסי ההמגלוטינציה בבארות, ורשום את התוצאות.