ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית
6 בספטמבר 2024
לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.
אלקטרופורציה מגדילה באופן זמני את חדירות קרום התא באמצעות פולסים חשמליים במתח גבוה. ישנם מספר טיפולים קליניים המתפתחים במהירות המבוססים על אלקטרופורציה המכוונים לתאי שריר ותאי עצב. לכן חיוני לחקור כיצד אלקטרופורציה משפיעה על יכולתם של תאים מעוררים אלה לעורר פוטנציאל פעולה.
ניסויים במבחנה חשובים מאוד כדי להבין את ההשפעות של אלקטרופורציה על תאים מעוררים. עם זאת, מיוציטים ותאי עצב ראשוניים הם בעלי פרופיל ביטוי מורכב מאוד של תעלות יונים שהופך את זה למאתגר ביותר לנתק את יחסי הגומלין בין עירור לאלקטרופורציה. פיתחנו פרוטוקול לניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה באמצעות תאי HEK מזנקים.
תאים אלה מבטאים השלמה מינימלית של תעלות נתרן ואשלגן שהופכות אותם למעוררים. לכן, תא זה פישט את הניסויים ואת הניתוח התיאורטי של התוצאות שהתקבלו. באמצעות הפרוטוקול שלנו, מצאנו כי אלקטרופורציה קלה מאוד כבר יכולה להשפיע באופן דרמטי על קבילות התאים.
תוצאות אלה יסללו את הדרך לפיתוח מודלים תיאורטיים של אלקטרופורציה וקבילות תאים, וזה יעזור לקהילה לשפר את הטיפולים מבוססי האלקטרופורציה המתפתחים במהירות בלב, במוח ובשרירי השלד. כדי להתחיל, פיפטה מיליליטר אחד של PBS לבאר אחת של מגלשות תא הזכוכית עם שתי הבארות. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת פולי-L-ליזין סטרילית, מיליגרם אחד למיליליטר, וערבב היטב עם פיפטה.
דגירה למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינרית, ולאחר מכן הסר את ה-PBS עם פולי-L-ליזין ללא כל כביסה נוספת. כדי לזרוע את התאים, הכינו דילול של 1 עד 10 של תמיסת מלאי דוקסיציקלין במדיום תרבית בצינור של 1.5 מיליליטר. כעת, הסר את מדיום התרבות מבקבוק ה- T-25.
נסה את התאים עם 2.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA בחממת פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. הוסף 2.5 מיליליטר של מדיום תרבית טרי ופיפטה בעדינות את התאים כדי לנתק אותם מהשטח. חשב את נפח תרחיף התאים הטריפסיני הדרוש להקמת התרבית.
הפחיתו את נפח השעיית התאים שחושב בעבר מ-1,470 מיקרוליטר כדי לחשב את נפח מדיום התרבית. להכנת דגימות עם תאי S HEK מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבות ותרחיף התאים הטריפסיני לבאר אחת. הוסף 30 מיקרוליטר מדילול הדוקסיציקלין.
מערבבים היטב על ידי פיפטה עדינה ממש לפני הכנסת התאים לאינקובטור הפחמן הדו חמצני. להכנת דגימות עם תאי NS HEK שאינם מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבית לבאר, והוסף 90% מהנפח המחושב של תרחיף התאים לתאי S HEK ללא דוקסיציקלין. דגרו את התאים בחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים-שלושה לפני הניסוי.
לפני הניסוי, פיפטה שלושה מיקרוליטר של תמיסת מלאי צבע פוטנציומטרית לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. השאירו את הצינור הפתוח בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינרי למשך כ-15 דקות כדי לאפשר לאתנול להתאדות ולצבע הפוטנציומטרי להתייבש, ולאחר מכן הוסיפו 997 מיקרוליטר של מדיום תרבית קרה בארבע מעלות צלזיוס לצינור כדי להמיס את הצבע לריכוז סופי של 12 מיקרומולר. לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות מהבאר.
הוסף מיליליטר אחד של תמיסת צבע פוטנציומטרית לתאים. מקררים את התאים בארבע מעלות צלזיוס ודוגרים עליהם למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצבע הפוטנציומטרית ושמור אותה בשפופרת לשימוש חוזר נוסף עד שישה ניסויים עוקבים ביום אחד.
שטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים בתמיסת טירוד. לאחר הכביסה האחרונה, פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת טירוד דלת אשלגן לבאר. כדי להתחיל, הכינו את תאי ה-HEK לאלקטרופורציה, ולאחר מכן הגדירו סנכרון של העברת הדופק עם רכישת תמונה באמצעות אות TTL ממערכת המיקרוסקופ המפעילה את מחולל הדופק.
בתחתית החדר, הניחו שתי אלקטרודות תיל פלטינה-אירידיום מקבילות בקוטר 0.8 מילימטרים ומרחק של חמישה מילימטרים בין הקצוות הפנימיים. תקן את החדר מתחת למיקרוסקופ ואז חבר את האלקטרודות למחולל הדופק. באמצעות בדיקת מתח וזרם, חבר את הפלט של מחולל הדופק לאוסילוסקופ כדי לאפשר אימות של העברת הדופק הנכונה במהלך הניסוי.
מקדו את התאים בשדה הבהיר ודמו את התאים הממוקמים באמצע בין האלקטרודות. השג 80 תמונות במצב זמן-lapse בקצב של לפחות 25 פריימים לשנייה. להאיר את התאים באורך גל עירור של 635 ננומטר, להגדיר את זמן החשיפה ל-10 אלפיות השנייה ולזהות את הפליטה בכ-700 ננומטר.
לאחר הרכישה יש להמתין שתי דקות. כוונן את המתח בממשק מחולל הדופק ל 63 וולט. הקלט קיטועי זמן באותו אופן כל שתי דקות.
במהלך רכישות אלה, הפעל פולס יחיד של 100 מיקרו-שנייה בזמן רכישת התמונה העשירית. רכוש תמונות עם מתחי פולסים של 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 ו-200 וולט. הערך את השדה החשמלי שאליו נחשפים התאים כיחס המתח למרחק האלקטרודה.
לניתוח נתונים, ייצא את הקלטות ה-Time-lapse לפורמט TIFF, ולאחר מכן מקם את כל הקלטות ה-Time-lapse של המתחים המופעלים מניסוי בודד בתיקיה אחת. שנה את השם של כל הקלטת זמן-lapse כך ש-MATLAB תוכל לזהות את השדה החשמלי. לרכישה בתחילת הניסוי, שבה לא מופעל דופק, שנה את שמו באמצעות הביטוי 000Vcm.
לאחר מכן, פתח את האפליקציה שהורדת מ-GitHub. לחץ על בחר תיקיית נתונים"כדי לבחור את התיקיה המכילה את הקלטות ה-Time-lapse של ניסוי אחד. לבחירת הפיקסלים, השתמשו בשני מחוונים לקביעת הסף הנמוך לתמונה ברורה של הממברנות והסף הגבוה לסילוק פסולת מהניתוח.
כעת, לחץ על נתח נתונים. בכרטיסייה ניתוח", תופיע טבלה עם פרמטרים שחולצו. בצד ימין של הטבלה יוצגו גרפים של פלואורסצנטיות יחסית לאורך זמן עבור כל שדה חשמלי בשימוש.
בחר את הגרפים עבור שדה חשמלי נתון מהתפריט הנפתח בצד שמאל מעל הטבלה. בדוק את כל הגרפים ובצע תיקון ידני במקרה של זיהוי שיא שגוי. בחר נקה פסגות אוטומטיות"בתחתית הכרטיסייה ניתוח" כדי לנקות את הפסגות שזוהו אוטומטית.
לחץ על הגרף כדי לקבוע ידנית נקודת זמן שיא חדשה. במידת הצורך, בחר הפעל מחדש זיהוי שיא אוטומטי"בתחתית הכרטיסייה ניתוח" כדי לבצע שוב זיהוי שיא אוטומטי. הפרמטרים שחולצו יותאמו כעת לשיא החדש.
לאחר מכן, בחר ייצוא נתונים"בפינה השמאלית התחתונה של הכרטיסייה ניתוח" כדי לייצא נתונים לאותה תיקיה כמו קובץ מפת נקודות, קובץ גיליון אלקטרוני ותמונות PNG עבור כל שדה חשמלי בשימוש. פולסים חשמליים של 126 וולט לסנטימטר הפעילו שיאי פלואורסצנציה מרובים בתאים מעוררים, כפי שמוצג על ידי התנודות הברורות בשינוי הקרינה לאורך זמן. עם הגדלת עוצמת השדה החשמלי, התגובה השתנתה והציגה דה-פולריזציה מתמשכת ב-400 וולט לסנטימטר.
תאים שאינם מעוררים לא הראו שיאים משמעותיים בתגובה לעוצמות השדה החשמלי הנמוכות ביותר, מה שמעיד על כך שלא עירור. בעוצמות שדה חשמלי גבוהות יותר, התאים הלא מעוררים הפגינו גם דה-פולריזציה מתמשכת, מה שמעיד על אלקטרופורציה. המספר המרבי של פסגות בתאים מעוררים נצפה ב-150 וולט לסנטימטר, עם מגמת ירידה במספר הפסגות ככל שהמתח גדל מעבר לנקודה זו.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את השפעות האלקטרופורציה על יצירת פוטנציאל פעולה בתאים מעוררים באמצעות מודל מהונדס גנטית. הפרוטוקול מתמקד בניטור אופטי של שינויים במתח הקרומי ובדינמיקה של פוטנציאל הפעולה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- אלקטרופורציה מגבירה את חדירות קרום התא באמצעות פולסים של מתח גבוה.
- הבנת השפעות האלקטרופורציה על תאים מעוררים היא קריטית ליישומים קליניים.
- מיוציטים ונוירונים ראשוניים מציבים אתגרים מורכבים לחקר אינטראקציות בין תעלות יונים.
- תאי HEK מספקים מודל מפושט למחקרים מסוג זה.
מטרת המחקר
- לניטור שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה המושרים על ידי אלקטרופורציה.
- שימוש בתאי HEK עם מערכת tet-on המפיקים פריקות (spiking) להשגת תובנות ברורות יותר.
- שיפור ההבנה לגבי השפעת האלקטרופורציה על התנהגות תאים בעלי יכולת גירוי (excitable cells).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות ניטור אופטי להערכת פוטנציאל פעולה.
- אלקטרופורציה המיושמת על תאי HEK מהונדסים גנטית.
- חילוץ אוטומטי של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים רלוונטיים.
- הסדרה ניסויית in-vitro לתצפיות מבוקרות.
תוצאות עיקריות
- אלקטרופורציה משפיעה באופן משמעותי על יצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK.
- שינויים במתח הטרנס-ממברנלי נוטרו בהצלחה.
- שיטות אוטומטיות סיפקו חילוץ נתונים מהימן.
- הממצאים תורמים להבנת השפעות האלקטרופורציה על תאים עירורים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך לחקר אלקטרופורציה בתאים מעוררים.
- התובנות שיושגו עשויות להוביל ליישומים קליניים המכוונים לתאי שריר ותאי עצב.
- מחקרים עתידיים יוכלו להרחיב את המשמעויות של ממצאים אלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טיפולים מבוססי אלקטרופורציה מכוונים יותר ויותר לרקמות עירור, אך השפעות שאינן במטרה על תאי עצב ותאי שריר מציבות אתגרים משמעותיים לבטיחות ולהשפעה. פרוטוקול זה מאפשר הערכה כמותית ובעלת תוכן גבוה של שינויים ביצירת פוטנציאל פעולה המושרים על ידי אלקטרופורציה, תוך שימוש במודל פשוט של תאי HEK שהונדסו גנטית. גישה זו תומכת בהסרת סיכונים חזויה ובבנה הבנת מנגנונים בנקודות זמן קריטיות של גילוי ומעבר לשלב הפרה-קליני עבור פורטפולי של חברות ביו-פארמה המפתחות שיטות טיפול המבוססות על אלקטרופורציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פארמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה שיטתית של השפעות האלקטרופורציה על תפקוד תאים עירורים באמצעות מערכת מבוקרת ומינימלית של תעלות יונים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד האינטראקציה בין עירור לאלקטרופורציה, ללא השפעות מטעות הנובעות מהמורכבות של התא הטבעי.
- מסייע בבניית ביטחון חיזוי לגבי מעורבות המטרה וסיכוני בטיחות בהתערבויות המבוססות על אלקטרופורציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקה בעלת שחזור, המנוטרת באופן אופטי, לכימות שינויים בפוטנציאל הפעולה בחוזקות שונות של שדה חשמלי.
- מספק מיצוי סטנדרטי ואוטומטי של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים לצורך השוואה מהימנה של נתונים.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של השפעות תרכובות או מכשירים על תגובות של תאים עירורים לאלקטרופורציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים במערכות in vitro למודלים תרגומיים של השפעות אלקטרופורציה ברקמות לב, עצב ושריר.
- תומך ברציפות, החל מתובנות מכניסטיות בשלב הגילוי ועד להערכת סיכונים פרה-קלינית לפיתוח טיפולי.
- מספק מידע על אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים לניטור שינויים תפקודיים ברקמות מטרה שנוצרו כתוצאה מאלקטרופורציה.
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
פרוטוקול זה משתלב ברצף מהשלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני עבור טיפולים מבוססי אלקטרופורציה, ובכך הוא מגשר בין תיקוף מכניסטי למידול תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את שיבוש פוטנציאל הפעולה ואת ההחלמה ממנו, ובכך מבהיר את השפעת האלקטרופורציה על תפקודם של תאים עירורים.
- סינון: מציע בדיקה סטנדרטית בעלת תוכן גבוה להערכת פרמטרים של פולסים חשמליים והתערבויות פוטנציאליות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות ואוטומטיות של מתח ממברנה ומדדי פוטנציאל פעולה להשוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: תומך במידול של תגובת מינון וספי סף בטיחות הרלוונטיים ליישומים in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים מכניסטיים והערכת סיכונים פרה-קלינית בתוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהשפעות האלקטרופורציה על תאים עירורים ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובנייה (scalable) לצורך אימוץ בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) ומיון יעיל של נכסים מבוססי אלקטרופורציה מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של טיפולים המכוונים לרקמות עירורים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, בדימות אופטי ובניתוח נתונים כמותי.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה, ליצירת פולסים ולתוכנה לניתוח אוטומטי.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים של הגדרות המבחן ופירוש הנתונים לצורך הדירות.
- התאמה למודלים אחרים של תאים עירורים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- הפירוש מוגבל להקשר המפושט של תעלות יונים בתאי HEK מהונדסים.
