ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

אלקטרופורציה מגדילה באופן זמני את חדירות קרום התא באמצעות פולסים חשמליים במתח גבוה. ישנם מספר טיפולים קליניים המתפתחים במהירות המבוססים על אלקטרופורציה המכוונים לתאי שריר ותאי עצב. לכן חיוני לחקור כיצד אלקטרופורציה משפיעה על יכולתם של תאים מעוררים אלה לעורר פוטנציאל פעולה.

ניסויים במבחנה חשובים מאוד כדי להבין את ההשפעות של אלקטרופורציה על תאים מעוררים. עם זאת, מיוציטים ותאי עצב ראשוניים הם בעלי פרופיל ביטוי מורכב מאוד של תעלות יונים שהופך את זה למאתגר ביותר לנתק את יחסי הגומלין בין עירור לאלקטרופורציה. פיתחנו פרוטוקול לניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה באמצעות תאי HEK מזנקים.

תאים אלה מבטאים השלמה מינימלית של תעלות נתרן ואשלגן שהופכות אותם למעוררים. לכן, תא זה פישט את הניסויים ואת הניתוח התיאורטי של התוצאות שהתקבלו. באמצעות הפרוטוקול שלנו, מצאנו כי אלקטרופורציה קלה מאוד כבר יכולה להשפיע באופן דרמטי על קבילות התאים.

תוצאות אלה יסללו את הדרך לפיתוח מודלים תיאורטיים של אלקטרופורציה וקבילות תאים, וזה יעזור לקהילה לשפר את הטיפולים מבוססי האלקטרופורציה המתפתחים במהירות בלב, במוח ובשרירי השלד. כדי להתחיל, פיפטה מיליליטר אחד של PBS לבאר אחת של מגלשות תא הזכוכית עם שתי הבארות. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת פולי-L-ליזין סטרילית, מיליגרם אחד למיליליטר, וערבב היטב עם פיפטה.

דגירה למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינרית, ולאחר מכן הסר את ה-PBS עם פולי-L-ליזין ללא כל כביסה נוספת. כדי לזרוע את התאים, הכינו דילול של 1 עד 10 של תמיסת מלאי דוקסיציקלין במדיום תרבית בצינור של 1.5 מיליליטר. כעת, הסר את מדיום התרבות מבקבוק ה- T-25.

נסה את התאים עם 2.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA בחממת פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. הוסף 2.5 מיליליטר של מדיום תרבית טרי ופיפטה בעדינות את התאים כדי לנתק אותם מהשטח. חשב את נפח תרחיף התאים הטריפסיני הדרוש להקמת התרבית.

הפחיתו את נפח השעיית התאים שחושב בעבר מ-1,470 מיקרוליטר כדי לחשב את נפח מדיום התרבית. להכנת דגימות עם תאי S HEK מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבות ותרחיף התאים הטריפסיני לבאר אחת. הוסף 30 מיקרוליטר מדילול הדוקסיציקלין.

מערבבים היטב על ידי פיפטה עדינה ממש לפני הכנסת התאים לאינקובטור הפחמן הדו חמצני. להכנת דגימות עם תאי NS HEK שאינם מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבית לבאר, והוסף 90% מהנפח המחושב של תרחיף התאים לתאי S HEK ללא דוקסיציקלין. דגרו את התאים בחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים-שלושה לפני הניסוי.

לפני הניסוי, פיפטה שלושה מיקרוליטר של תמיסת מלאי צבע פוטנציומטרית לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. השאירו את הצינור הפתוח בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינרי למשך כ-15 דקות כדי לאפשר לאתנול להתאדות ולצבע הפוטנציומטרי להתייבש, ולאחר מכן הוסיפו 997 מיקרוליטר של מדיום תרבית קרה בארבע מעלות צלזיוס לצינור כדי להמיס את הצבע לריכוז סופי של 12 מיקרומולר. לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות מהבאר.

הוסף מיליליטר אחד של תמיסת צבע פוטנציומטרית לתאים. מקררים את התאים בארבע מעלות צלזיוס ודוגרים עליהם למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצבע הפוטנציומטרית ושמור אותה בשפופרת לשימוש חוזר נוסף עד שישה ניסויים עוקבים ביום אחד.

שטפו בעדינות את התאים שלוש פעמים בתמיסת טירוד. לאחר הכביסה האחרונה, פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת טירוד דלת אשלגן לבאר. כדי להתחיל, הכינו את תאי ה-HEK לאלקטרופורציה, ולאחר מכן הגדירו סנכרון של העברת הדופק עם רכישת תמונה באמצעות אות TTL ממערכת המיקרוסקופ המפעילה את מחולל הדופק.

בתחתית החדר, הניחו שתי אלקטרודות תיל פלטינה-אירידיום מקבילות בקוטר 0.8 מילימטרים ומרחק של חמישה מילימטרים בין הקצוות הפנימיים. תקן את החדר מתחת למיקרוסקופ ואז חבר את האלקטרודות למחולל הדופק. באמצעות בדיקת מתח וזרם, חבר את הפלט של מחולל הדופק לאוסילוסקופ כדי לאפשר אימות של העברת הדופק הנכונה במהלך הניסוי.

מקדו את התאים בשדה הבהיר ודמו את התאים הממוקמים באמצע בין האלקטרודות. השג 80 תמונות במצב זמן-lapse בקצב של לפחות 25 פריימים לשנייה. להאיר את התאים באורך גל עירור של 635 ננומטר, להגדיר את זמן החשיפה ל-10 אלפיות השנייה ולזהות את הפליטה בכ-700 ננומטר.

לאחר הרכישה יש להמתין שתי דקות. כוונן את המתח בממשק מחולל הדופק ל 63 וולט. הקלט קיטועי זמן באותו אופן כל שתי דקות.

במהלך רכישות אלה, הפעל פולס יחיד של 100 מיקרו-שנייה בזמן רכישת התמונה העשירית. רכוש תמונות עם מתחי פולסים של 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 ו-200 וולט. הערך את השדה החשמלי שאליו נחשפים התאים כיחס המתח למרחק האלקטרודה.

לניתוח נתונים, ייצא את הקלטות ה-Time-lapse לפורמט TIFF, ולאחר מכן מקם את כל הקלטות ה-Time-lapse של המתחים המופעלים מניסוי בודד בתיקיה אחת. שנה את השם של כל הקלטת זמן-lapse כך ש-MATLAB תוכל לזהות את השדה החשמלי. לרכישה בתחילת הניסוי, שבה לא מופעל דופק, שנה את שמו באמצעות הביטוי 000Vcm.

לאחר מכן, פתח את האפליקציה שהורדת מ-GitHub. לחץ על בחר תיקיית נתונים"כדי לבחור את התיקיה המכילה את הקלטות ה-Time-lapse של ניסוי אחד. לבחירת הפיקסלים, השתמשו בשני מחוונים לקביעת הסף הנמוך לתמונה ברורה של הממברנות והסף הגבוה לסילוק פסולת מהניתוח.

כעת, לחץ על נתח נתונים. בכרטיסייה ניתוח", תופיע טבלה עם פרמטרים שחולצו. בצד ימין של הטבלה יוצגו גרפים של פלואורסצנטיות יחסית לאורך זמן עבור כל שדה חשמלי בשימוש.

בחר את הגרפים עבור שדה חשמלי נתון מהתפריט הנפתח בצד שמאל מעל הטבלה. בדוק את כל הגרפים ובצע תיקון ידני במקרה של זיהוי שיא שגוי. בחר נקה פסגות אוטומטיות"בתחתית הכרטיסייה ניתוח" כדי לנקות את הפסגות שזוהו אוטומטית.

לחץ על הגרף כדי לקבוע ידנית נקודת זמן שיא חדשה. במידת הצורך, בחר הפעל מחדש זיהוי שיא אוטומטי"בתחתית הכרטיסייה ניתוח" כדי לבצע שוב זיהוי שיא אוטומטי. הפרמטרים שחולצו יותאמו כעת לשיא החדש.

לאחר מכן, בחר ייצוא נתונים"בפינה השמאלית התחתונה של הכרטיסייה ניתוח" כדי לייצא נתונים לאותה תיקיה כמו קובץ מפת נקודות, קובץ גיליון אלקטרוני ותמונות PNG עבור כל שדה חשמלי בשימוש. פולסים חשמליים של 126 וולט לסנטימטר הפעילו שיאי פלואורסצנציה מרובים בתאים מעוררים, כפי שמוצג על ידי התנודות הברורות בשינוי הקרינה לאורך זמן. עם הגדלת עוצמת השדה החשמלי, התגובה השתנתה והציגה דה-פולריזציה מתמשכת ב-400 וולט לסנטימטר.

תאים שאינם מעוררים לא הראו שיאים משמעותיים בתגובה לעוצמות השדה החשמלי הנמוכות ביותר, מה שמעיד על כך שלא עירור. בעוצמות שדה חשמלי גבוהות יותר, התאים הלא מעוררים הפגינו גם דה-פולריזציה מתמשכת, מה שמעיד על אלקטרופורציה. המספר המרבי של פסגות בתאים מעוררים נצפה ב-150 וולט לסנטימטר, עם מגמת ירידה במספר הפסגות ככל שהמתח גדל מעבר לנקודה זו.