Name: פרוטוקול לתרביות אקספלנט של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: למד שיטת אקספלנט ללא אנזימים לתרבות גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1. פרוטוקול זה שומר על ביטוי חלבון IDH1 ותומך בתרביות לטווח ארוך למחקר גליומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

שברי הגידול המשמשים כאן הם חלק מאוסף NEUROLOGY של דגימות רקמה טריות המנוהל על ידי מרכז המשאבים הביולוגיים בבית החולים האוניברסיטאי מונפלייה (CRB@chu-montpellier.fr). מחקר זה נערך במסגרת הפרויקט שכותרתו "Gliomacult: אפיון ותרבויות ראשוניות של גליומות בדרגה נמוכה", בהובלת פרופ' J. P. Hugnot (פרויקט מס. RECH/P722/1-5). עבודה זו נתמכה על ידי La ligue contre le cancer, ARC (האגודה לחקר הסרטן), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. KAC נתמך על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה במדעי הרוח (CONAHCYT), מקסיקו, והאגודה לחקר גידולי מוח (ARTC), צרפת.

מקטעי הגידול ששימשו בפרוטוקול זה הופקו מאוסף מאופיין היטב ואושר מבחינה אתית, בהסכמת המטופלים. מחקר זה נערך במסגרת הפרויקט שכותרתו Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (מספר פרויקט RECH/P722/1-5) ואושר על ידי המועצה המדעית של בנק הביו לגידולים ב-28 באוגוסט 2023.
1. הכנת פלטות תרבית
הערה: יש לבצע שלבים אלו תחת מנשף זרימה למינרית סטרילי לתרביות רקמה.
<ol>
	<li>לפחות שעה אחת לפני התרבית, הכינו פלטות בעלות 24 בארות מצופות poly-D-lysine (PDL) ולמינין.
	<ol>
		<li>דללו 10 mg של אבקת PDL ב-100 mL של בופר בוראט (pH 8.4) עד לריכוז סופי של 100 µg/mL. לאחר ההמסה, סננו את התמיסה (0.22 µm) לצורך סטריליות. ה-PDL מוכן לשימוש; הכינו אליקוטים של 3 mL ואחסנו אותם ב-20 °C-.</li>
		<li>הפשיתו את מבחורת הלמינין בריכוז 1-2 mg/mL ב-4 °C כדי למנוע היווצרות ג'ל. הכינו אליקוטים של 50 µL ואחסנו אותם ב-20 °C-. 
		הערה: יש להימנע מהפשרה והקפאה חוזרות.</li>
		<li>ציפוי הפלטה
		<ol>
			<li>שלב אופציונלי: הניחו כיסית זכוכית סטרילית בקוטר 13 mm, המתאימה למשטחי תרבית תאים, בתוך פלטה בעלת 24 בארות, כיסית אחת לכל בארה. 
			הערה: שלב זה נועד לצביעה אימונוהיסטוכימית עתידית של נתיחי גליומה (glioma explants).</li>
			<li>עבור ציפוי הבארות, ערבבו 3 mL של תמיסת PDL עם 9 mL של 1x PBS והוסיפו 50 µL של למינין. הוסיפו 500 µL מתמיסה זו לכל בארה כדי להגיע לריכוז ציפוי של 1-2 µg/cm². הדגרימו את הפלטות המצופות בטמפרטורת החדר, רצוי עם ניעור איטי (15 RPM), למשך שעה אחת לפחות.</li>
			<li>מייד לפני התרבית, הסירו את תמיסת ה-PDL-למינין ושטפו פעמיים עם 1x PBS סטרילי. 
			הערה: אין לאפשר לבארות להתייבש.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. מצעים
<ol>
	<li>תרבתו נגעי רקמה (explants) עם מוטציה ב-IDH1 במצע מוגדר המורכב מ-DMEM/F12 בתוספת L-glutamine, יחד עם תערובת תחליפי סרום הכוללת N2 ו-B27 ללא ויטמין A. השתמש באנטיביוטיקה, כולל ciprofloxacin, gentamicin ו-fungin, כדי למנוע זיהום חיידקי ופטרייתי. בנוסף, הוסף למצע את גורמי הגדילה heparin, EGF ו-FGF2, סנן אותו (0.2 µm) ושמור אותו למשך עד שבועיים בטמפרטורה של 4 °C. 
	הערה: לפרטים על רכיבי המצע והכנתו, עיין ב-טבלה 1 וב-טבלת החומרים.</li>
</ol>
3. הכנת הבלת (Explant)
<ol>
	<li>לפני עיבוד הדגימה, הכין את מרחב העבודה והכלים הסטריליים כפי שמוצג ב-איור 1A. חטא מארז קירור על ידי ריסוס ב-70% ethanol. סטריליז מספריים ופינצטה על ידי טבילה ב-70% ethanol ושטיפה ב-PBS.</li>
	<li>העבר במהירות את הגזירת הגידול לתרבית על קרח, באופן אידיאלי תוך 2 h מההוצאה הכירורגית (איור 1B). 
	הערה: לדגימת הגידול צריך להיות קוטר מינימלי של 9-10 mm כדי להבטיח תוצאות טובות יותר. הרקמה מועברת ללא מצע תרבית שכן שיטה זו מועדפת למטרות היסטולוגיות. היעדר נוזל מונע היווצרות גבישי קרח במהלך הקפאה מהירה, ובכך שומר על שלמות הרקמה לבדיקה היסטולוגית מאוחרת יותר במידת הצורך.</li>
	<li>הנח את צלח התרבית עם דגימת הגידול מעל מארז הקירור ושטוף בעדינות ב-1X PBS כדי להסיר דם עודף.</li>
	<li>הגידול הגזור מציג לעיתים קרובות גודל והטרוגניות משמעותיים, המורכבים ממסת הגידול, רקמה חודרת ומרכיבים שאינם גידוליים (איור 1C). בחר חלקים המציגים צבע אפור עם מרקם רך או ג'לטיני לצורך בידוד תאי גידול, שכן נטייתם היא להכיל יותר תאי גידול. לעומת זאת, הימנע מאזורים קשים ולבנים שכן ייתכן שהם מכילים פחות תאי גידול המתאימים לתרבית (איור 1D), וכן מאזורים שהשחירו, שכן הם ככל הנראה תוצאה של כריתה חשמלית (electrocautery) ועשויים שלא לספק תוצאות מהימנות לניתוח.</li>
	<li>העבר את הדגימות הנבחרות למיקרו-מבחנה של 1.5 mL או ל-cryovial לצורך קיצוץ. הוסף 1 mL של מצע סטרילי למיקרו-מבחנה או ל-cryovial וקצץ את הדגימה באמצעות המספריים הסטריליים עד לקבלת חתיכות קטנות (1-2 mm3). 
	הערה: נדרשות כ-1-2 min של קיצוץ כדי להשיג פרגמנטים זעירים, בדרך כלל בגודל של 1-2 mm3 (איור 1E).</li>
	<li>בעזרת מספריים סטריליים, קצץ בזהירות את קצהו של טיפ פיפטה כחול של 1,000 µL כדי ליצור פתח רחב, בקוטר של כ-3-4 mm. באמצעות טיפ זה, שאיב 50-200 µL של פרגמנטים של רקמה מקוצצת ופזז אותם באופן שווה בכל באר. מכיוון שחלקים קטנים יותר נוטים לשקוע במהירות, בצע הומוגניזציה מחדש עדינה של התמיסה בכל באר כדי להבטיח פיזור אחיד. 
	​הערה: הימנע מצפיפות יתר ושמור על איזון על ידי אי-החדרה של מספר מופרז של פרגמנטים לכל באר (איור 1F).</li>
	<li>דגור את פרגמנטים הגידול ב-37°C באינקובטור 5% CO2 עם 100% לחות. החלף את המצע מדי יום אם הפעילות המטבולית של הגידול (המסומנת על ידי הצהבה מהירה של המצע) ומספר הפרגמנטים בכל באר מחייבים זאת. במהלך החלפת המצע, פעל בזהירות על ידי שאיבה עדינה של המצע באמצעות פיפטה מצוידת בטיפ של 200 µL, תוך הקפדה שלא להפריע לפרגמנטים של גידול הדבקים לבאר.</li>
</ol>
<img alt="תהליך הכנת רקמת גידול; הגדרת ציוד; דגימות רקמה; תוצאות צנטריפוגה; תרשים ניתוח." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="איור 1"> 
איור 1: הליך תרבית נטיפות גידול (explant culture). נלקחה כריתה של גליומה דיפוזית בדרגה נמוכה ממטופל בן 44 שאובחן עם אסטרוציטומה בדרגה II לפי סיווג ה-WHO 2021. הגידול הראה מוטציה ב-IDH1 (Exon 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His) ומוטציה ב-TP53 (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), לצד היעדר צביעה של ATRX. לא זוהו מוטציות באתרי קישור Ets/TCF (C250T ו-C228T) של הגן TERT. (A) משטח העבודה כולל מארז קירור, המספק סביבה הממזערת את הת tho-פירוק של הדגימה ושומרת על חיוניות הרכיבים הביולוגיים. אמצעי זהירות אלו חשובים לשימור האיכות והשלמות של הרקמה. (B) הובלת הדגימה מבית החולים למעבדה צריכה להתבצע על קרח. (C) פסיקת כריתת הגידול. החצים מצביעים על החלקים המתאימים ביותר לתרבית. (D) ביצוע דיסקציה של הגידול כדי לבחור את החלק הרלוונטי ביותר לקיצוץ. בניסיוננו, חומר לבן הוא בדרך כלל פחות נוטה להניב נטיפות מוצלחות. (E) פסיקי גידול בקוטר של כ-1-2 mm³ במבחנה של 15 mL לאחר קיצוץ מכני בעזרת מספריים. (F) מספר חלקי הגידול הדרושים לזריעה נכונה מוצג עבור באריים בלוח של 24 באריים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. הקפאה והפשרה של גידולי גידול קצוצים
הערה: שימור בהקפאה מבטיח גיבוי במקרה של זיהום ואובדן של תרביות אקספלנטים או לצורך עיבוד דגימות הגידול במועד מאוחר יותר.
<ol>
	<li>הקפאה (Cryopreservation): הכינו את תמיסת ההקפאה (תמיסת 20% v/v DMSO) על ידי הוספת 2 mL של DMSO ל-8 mL של מצע תרבית תאים.</li>
	<li>ערבבו נפח אחד של תרחיף הגידול הגרוס עם נפח שווה של תמיסת ההקפאה 20% DMSO כדי להגיע לריכוז סופי של 10% DMSO. העבירו את התערובת בעזרת פיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי להבטיח ערבוב יסודי, ולאחר מכן העבירו כ-1 mL למבחנות הקפאה (cryovials).</li>
	<li>העבירו במהירות את מבחנות ההקפאה למכל קריוגני להורדה הדרגתית של הטמפרטורה, ולאחר מכן דגרו למשך לילה ב-80 °C- לפני אחסון סופי בחנקן נוזלי. 
	הערה: יש לבצע שלב זה מיד לאחר העברת התאים לתמיסת ההקפאה, שכן קריו-פרוטקטורים מסוימים, כגון DMSO, עלולים להיות מזיקים אם התאים חשופים אליהם בטמפרטורת החדר למשך זמן רב מדי.</li>
	<li>הפשרה: הוציאו את מבחנות ההקפאה מהחנקן הנוזלי והניחו אותן מיד באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C עד להפשרת כ-80% מהתאים.</li>
	<li>להסרת ה-DMSO, העבירו במהירות בעזרת פיפטה את התרחיף למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL המכילה 5 mL של 1x PBS שחומם מראש, וצנטריפגו ב-300 × g למשך 5 min.</li>
	<li>הסִירו את העלייה (supernatant) וחזרו על השטיפה עם 1X PBS, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה (שלב 4.5). שאבו את העלייה, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע (pellet), והוסיפו את כמות המצע המתאימה להעברה לפלטה של 24 בארות מצופה מראש ב-PDL-Laminin והניחו באינקובטור.</li>
	<li>לאחר 24 h, ודאו שהתאים נצמדו. לאחר מספר ימים, הסירו פרגמנטים שאינם נצמדים על ידי החלפת מצע התרבית.</li>
</ol>
5. מעבר של התרבית
הערה: לאחר ביסוסם, ניתן להשתמש ברקימות המגולמנו (explants) למיקרוסקופיה וידאו או לצביעה אימונוהיסטוכימית. לחלופין, אם תאי גידול נדדו מחוץ לרקמה המגולמנת ונראים בריאים, ניתן להעביר את הרקמה המגולמנת למעבר (passage) באמצעות דיסוציאציה אנזימטית ולזרוע אותם מחדש בבארות לצורך ניסויים נוספים. עם זאת, חשוב לציין כי פרוטוקול זה אינו מיועד למעברים חוזרים. בדרך כלל, ניתן לנסות לבצע מעבר בודד בלבד לפני שתאי הגידול הופכים לסנסטים (senescent) או מתים. לא כל תרביות הרקמה המגולמנת יביאו למעבר מוצלח.
<ol>
	<li>לצורך תתיע (passage), הסיר את המדיום הישן, שטוף עם 1X PBS, והוסף (125 µL) של 0.05% trypsin-EDTA לבארים והדגר למשך 3-4 דקות ב-37 °C, ולאחר מכן הוסף 6.5 µL של Trypsin Inhibitor, 12 µL של 20 mM CaCl2 (דילול סופי ל-2mM), ו-1 µL של DNAse I. 
	הערה: זמן ההדגרה הדרוש לפירוק עשוי להשתנות בהתאם לתרבית. חשוב לבדוק האם התאים התנתקו לאחר 3 דקות לפחות. בדרך כלל, ייתכן שהאקספלנט (explant) לא יתפרק באופן מלא לתגלה של תאים בודדים, ולעתים נשמרים צברים קטנים, שעלולים להוליד תרביות אקספלנט חדשות.</li>
	<li>באמצעות פיפט p1000 המכוון ל-500-600 µL, בצע שטיפות עדינות כדי לפרק את האקספלנטים. הימנע מהיווצרות בועות.</li>
	<li>הוסף 5 mL של 1x PBS וסבב בצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 × g. שאב את הנוזל העליון (supernatant), השהה מחדש את המשקע (pellet) במדיום טרי שחומם מראש, וספור את התאים לצורך זריעה.</li>
	<li>זהה תרביות בעלות פוטנציאל ליצירת קווי תאים על ידי צפייה בתאים המתחלקים תחת מיקרוסקופ ניגודי פאזה (phase-contrast microscope). לתאים מתחלקים אלה יש בדרך כלל מורפולוגיה עגולה וכרומוזומים גלויים, כפי שמוצג ב-איור 2A.</li>
</ol>

<ol><li>Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of low-grade gliomas.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).</li>
<li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li>
<li>Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+low-grade+glioma+-+changing+concepts+in+diagnosis+and+management%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review.</a> Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).</li>
<li>Louis, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathology+of+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathology of malignant gliomas.</a> Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).</li>
<li>Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiotherapy+on+diffuse+low-grade+gliomas+evolution%3A+Confronting+theory+with+clinical+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data.</a> J Pers Med. 11 (8), 818(2021).</li>
<li>Pirozzi, C. J., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implications+of+idh+mutations+for+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The implications of idh mutations for cancer development and therapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).</li>
<li>Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+infiltrating+oligodendroglioma+and+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma.</a> J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).</li>
<li>Suva, M. L., Tirosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glioma+stem+cell+model+in+the+era+of+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics.</a> Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).</li>
<li>Augustus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CRYAB%2B+KCNN3%2B+SOX9%2B+astrocyte-like+and+EGFR%2B+PDGFRA%2B+OLIG1%2B+oligodendrocyte-like+tumoral+cells+in+diffuse+idh1-mutant+gliomas+and+implication+of+NOTCH1+signalling+in+their+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).</li>
<li>Hubert, C. G., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+as+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants as tumor models.</a> Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).</li>
<li>Abdullah, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+organoid+models+of+lower-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma.</a> Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).</li>
<li>Yuzhakova, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3d+tumor+spheroid+model+from+the+patient%27s+glioblastoma+cells+and+its+study+by+metabolic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sovrem+Tekhnologii+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging.</a> Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).</li>
<li>Kloosterman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+microglia+across+contexts+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of microglia across contexts of health and disease.</a> Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).</li>
<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

פיתוח מודלים במעבדה (in vitro) ומודלים פרה-קליניים עבור גליומות בדרגה נמוכה עם מוטציה ב-IDH1 הוא מאתגר במיוחד בשל הצמיחה האיטית של גידולים אלו והמורכבות של שכפול השינויים הגנומיים והאפיגנומיים הנרחבים הנגרמים על ידי מוטציית ה-IDH. יתרה מכך, תאי גידול חודרניים אלו מקיימים אינטראקציה פעילה עם תאים סביבם, כולל תאי מערכת החיסון, תאים אנדותליאליים, תאי גליה ותאי עצב, ועשויים להסתמך עליהם לצורך הישרדותם. קשרים מורכבים אלו קשים לשכפול בסביבת מעבדה.
כדי לחשוף תובנות ביולוגיות חדשות לגבי גליומות בדרגה ...

גליומות מפוזרות הן גידולי המוח הראשוניים השכיחים ביותר. גידולים אלה חשוכי מרפא כיום למרות טיפול אינטנסיבי מאוד (ניתוח, רדיו וכימותרפיה)1. ראיות הולכות וגדלות תומכות בהשערה שגליומגנזה מקורה בתאי גזע בוגרים או תאי אב גליה השוכנים במוח2. למרות שגליובלסטומה מייצגת את הסוג האגרסיבי ביותר, גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה (DLGG, גידולים בדרגה 2) נפוצות גם הן (15% מהגליומות המפוזרות)1,3. DLGGs גדלים לאט ונודדים לאורך מסלולים של חומר לבן, סימן היכר של ניאופלזמה4. DLGG אלה חוזרים לעתים קרובות למרות הטיפול, ובסופו של דבר מתקדמים לממאירות בדרגה גבוהה (כיתות 3 ו-4)5.
DLGG מאופיינים במוטציה שגויה בגן איזוציטראט דהידרוגנאז 1 או 2 (IDH1 או IDH2), וכתוצאה מכך ייצור חריג של האונקומטבוליט 2-הידרוקסיגלוטראט (2HG). זה משבש את התמיינות התאים באמצעות חוסר רגולציה אפיגנטית6. גליומות מוטנטיות IDH1 מסווגות עוד יותר לתת-סוגים: לאסטרוציטומה יש בדרך כלל מוטציות ב-ATRX ו-P53, בעוד שאוליגודנדרוגליומות מאופיינות ב-1p19q מחיקות7. גידולים אלה מציגים הטרוגניות של תאים גידוליים. ריצוף RNA של תאים בודדים ואפיון אימונולוגי חשפו אוכלוסייה מגוונת של תאי גידול, המציגים פנוטיפים דמויי תאי גזע, דמויי אסטרוציטים ודמויי אוליגודנדרוציטים בתוך גידולים אלה8,9.
בניגוד לגליובלסטומה, הנהנית מתרביות וקווי תאים זמינים לטווח ארוך, קיים מחסור בולט בכלים תאיים המותאמים לחקירת גידולים מוטנטיים IDH11. זה מהווה מכשול משמעותי לקידום הפיתוח הטיפולי ולהעמקת ההבנה שלנו לגבי גליומגנזה עם מוטציה IDH1 והתקדמות המחלה. קווי תאים מסורתיים שגדלו בסרום, בעוד שהם מנוצלים זמן רב, אינם משכפלים כראוי גידולים מקוריים, ומציגים פרופילי שעתוק ששונו. לחלופין, תנאי תרבית ללא סרום, בין אם במודלים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, משמרים בצורה יעילה יותר את פרופילי השעתוק של תאי הגידול ואת הפנוטיפים שלהם in vivo, כגון פלישה לרקמת מוח רגילה10,11.
בנוסף, תרביות תאים לטווח קצר שמקורן בדגימה כירורגית של המטופל משמרות את הפרופיל המולקולרי והמגוון התאי של הגידול, ובכך מייצגות טוב יותר את התכונות הביולוגיות של הגידולים בהשוואה לקווי תאים12. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ולא אנזימטית לתרבית תרבית גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 כצמחים שמקורם בכריתות חולים טריים או קפואים, במטרה לענות על הצורך במודלים משופרים במבחנה למחקר גליומה ופיתוח טיפולי. הם גם מציעים את הפוטנציאל להפיק קווי תאים מוטנטיים IDH1.

<table><tbody><tr><td>אנטי-ASCL1</td><td>BD Pharmingen ומסחר;</td><td>דילול 556604</td><td>1:500</td></tr><tr><td>דילול אנטי-ATRX</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>HPA001906</td><td>1:100</td></tr><tr><td>דילול אנטי-CD68</td><td>אג'ילנט</td><td>M081401-2</td><td>1:500</td></tr><tr><td>דילול אנטי-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד IBA1</td><td>פוג'יפילם וואקו</td><td>019-19741</td><td>דילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי נגד IDH1 (R132H) עכבר</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>556003</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-OLIG1</td><td>R& D Systems&reg;</td><td>AF2417</td><td>Dulituion 1:300</td></tr><tr><td>דילול Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Anti-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>EPR14335-78</td><td>דילול 1:100</td></tr><tr><td>תוסף B-27 (פי 50), פחות ויטמין A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>מיכל הקפאת תאים, עבור בקבוקונים קריוגניים 12 x 1 מ"ל או 2 מ"ל</td></tr><tr><td>כיסוי החלקה &Oslash;, 13 מ"מ</td><td>Karl Hecht&trade; סיוע ומסחר;</td><td></td><td></td>328017</tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, ללא גלוטמין</td><td>תרמו פישר 21331020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA I</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו ופריים; s פוספט חוצץ מלח (PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 מ"מ TC מטופל צלחת תרבית תאים</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>353003 Falcon 24-well Clear Flat Bottom</td><td>Corning&reg;</td><td>353047</td><td>צלחת תרבית תאים Multiwell שטופלה ב-TC, עם מכסה, סטרילי&nbsp;</td></tr><tr><td>Fungin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>אנושי</td><td>EGF PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>אנושי FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2 תוסף (100x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>סרום מסנן מזרק 37 מ"מ עם GF/0.2 ומיקרו; m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בשדה רחב ישר</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לתרביות אקספלנט של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה idh1

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

גליומות מפושטות, גידולי המוח הראשוניים הנפוצים ביותר, מסווגים לדרגות נמוכות וגבוהות על סמך קריטריונים היסטופתולוגיים ומוטציות גנטיות. גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה מהוות תת-קבוצה, הפוגעת בעיקר במבוגרים צעירים ונוטה לגליומות בדרגה גבוהה. ישנם שני סוגים עיקריים של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה: אסטרוציטומה ואוליגודנדרוגליומות, כל אחת מוגדרת על ידי מאפיינים גנטיים והיסטולוגיים מובחנים. גידולים אלה מציגים באופן אופייני גרסה מוטנטית של האנזים המטבולי IDH1, המשבשת את ההתמיינות התאית. הם הטרוגניים, וכוללים גם תאי גזע מתרבים וגם תאי גליה ממוינים ושקטים יותר. 
מודלים ספציפיים לחולה, גידולים במבחנה מחזיקים בפוטנציאל משמעותי לחשיפת מנגנונים אונקוגניים והתאמת בחירת תרופות לטיפול מותאם אישית. עם זאת, היעדר מודלים אמינים במבחנה במיוחד עבור גליומות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 עיכב מחקר בסיסי ותרגומי. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתרבית גידולים מוטנטיים IDH1 כאקספלנטים במדיה מוגדרת ללא צורך בדיסוציאציה אנזימטית. ניתן לשמור על אקספלנטים אלה לתקופות ממושכות, תוך שמירה על ביטוי חלבון מוטנטי IDH1 וכן סמנים לתאי אב אוליגודנדרוציטים כגון ASCL1 (MASH1), OLIG1 ו-OLIG2 ולאסטרוציטים (GFAP, SOX9). הם יכולים להיווצר גם מגידולים קפואים ב-DMSO. תרביות אלו יכולות לשמש פלטפורמה רבת ערך לסינון תרופות, מיקרוסקופיה ומחקרי גנים, ובכך להקל על התקדמות בהבנה וטיפול בגידולים מאתגרים אלה. הם גם מציעים את הפוטנציאל להפיק קווי תאים מוטנטיים IDH1.

לאחר מספר ימים, חלק מרגמני הגידול ייצמדו למשטחי הבארים, מה שיביא להתחלת צמיחה של תאים מהרקמות המושתלות (explants). הזמן שחולף בין הזריעה הראשונית להופעת תאי גידול צומחים משתנה מדגימה לדגימה. התרביות הראשוניות מכילות לעיתים קרובות כמות ניכרת של פסד תאי, מה שמקשה על הערכת נוכחותם של תאים חיוניים. כתוצאה מכך, יש לתחזק את התרבית למשך 4 שבועות לפחות. ברגע שהתאים מתחילים לגדול, ניתן להבחין בתאים מוארכים בעלי מראה ביפולרי או מולטיפולרי (איור 2B,C).
בעת ה...

גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 הן גידולים נדירים שקשה לתרבת. אנו מציגים שיטה פשוטה ולא אנזימטית המשמרת ביטוי חלבון מוטנטי IDH1 ומקיימת תרביות במשך חודשים. חשוב לציין, טכניקה זו עובדת עם גידולים שמורים בהקפאה, ומציעה משאב רב ערך לחקר גליומה.

פרוטוקול לתרביות אקספלנט של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

a-protocol-for-explant-cultures-idh1-mutant-diffuse-low-grade

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של תאי אב גליה מגליומה פונטין פנימית מפוזרת, או רקמת גזע המוח המושפעת מ- DIPG. תאי גליה שבודדו מרקמת הגידול באמצעות עיכול אנזימטי מתורבתים בתווך נוירובזאלי, המקדם את גדילתם ואת התפתחותן של נוירוספרות צפות בחופשיות.

בידוד וטיפוח תאים מגליומה פונטינה פנימית מפוזרת

גליומות ממאירות מהוות קבוצה הטרוגנית של ניאופלסמות גליה מסתננות מאוד עם תכונות קליניות ומולקולריות מובהקות. קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים מסכמים מחדש את התכונות ההיסטופתולוגיות והמולקולריות של תת-סוגים ממאירים של גליומה במודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים.

גליומה אורתוטופית ראשונית קסנוגרפטים recapitulate צמיחה הסתננות איזוציטראט דהידרוגנאז אני מוטציה

פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד המהיר של דגימות גליומה pontine מהותיות מפוזרות שלאחר מוות להקמת מודלי תרבית תאים שמקורם בחולה או אפיון ישיר של תאים סרטניים microenvironmental.

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.

ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

כאן אנו מציגים מערכת התרבות הvivo לשעבר מעורב מעורבת לחקר התא glioma האדם (hGC) הגירה בזמן אמת. מודל זה מספק את היכולת להתבונן באינטראקציות בין השמאל לבין האקטונים המייאלואידית והלא-מיאלואידית בתוך תא מחולק.

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

במאמר זה אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים של גליובלסטומה (GBM) מדגימות של מטופלים ראשוניים או מתרביות תאים שמקורן בחולה, ושמירה עליהם עד לבגרות. אורגנואידים אלה של GBM מכילים אוכלוסיות תאים מגוונות מבחינה פנוטיפית ויוצרים מחדש מיקרו-סביבה של גידולים ex vivo.

שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית Ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית

למד שיטת אקספלנט ללא אנזימים לתרבות גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1. פרוטוקול זה שומר על ביטוי חלבון IDH1 ותומך בתרביות לטווח ארוך למחקר גליומה.

פרוטוקול לתרביות אקספלנט של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1

גלה סרטונים נוספים