Name: הדמיית FRET של מולקולה אחת להתבוננות בדינמיקת הקונפורמציה של GTPase Atlastin דמוי דינמין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למד את הדינמיקה הקונפורמציונלית של חלבון Atlastin במהלך מחזור הידרוליזת GTP באמצעות smFRET. שיטה זו מאפשרת מעקב מדויק אחרי שינויי מבנה חלבונים ברמת מולקולה בודדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>ניטור GTPase Atlastin במצבי טעינת נוקלאוטידים שונים

<ol><li>Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins.</a> Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).</li>
<li>Kalia, R., Frost, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+and+cut%3A+Allosteric+motion+and+membrane+fission+by+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins.</a> Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).</li>
<li>Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamin superfamily.</a> Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).</li>
<li>Bryce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastin-3+is+a+constitutive+ER+membrane+fusion+catalyst%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst.</a> J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).</li>
<li>Crosby, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+human+atlastin+fusion+activity+reveals+autoinhibition+by+the+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus.</a> J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+dynamin-like+GTPases+involved+in+the+generation+of+the+tubular+er+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network.</a> Cell. 138 (3), 549-561 (2009).</li>
<li>Jang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastins+are+sufficient+to+drive+the+fusion+of+liposomes+with+a+physiological+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition.</a> J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin-1+regulates+morphology+and+function+of+endoplasmic+reticulum+in+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites.</a> Nat Commun. 10 (1), 568(2019).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+gtpase+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin.</a> Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).</li>
<li>Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin+GTPases+are+required+for+Golgi+apparatus+and+er+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis.</a> Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).</li>
<li>Faust, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+C-terminal+tail+is+an+amphipathic+helix+that+perturbs+the+bilayer+structure+during+endoplasmic+reticulum+homotypic+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion.</a> J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).</li>
<li>Liu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+interaction+of+the+c+terminus+and+association+of+the+transmembrane+segments+facilitate+atlastin-mediated+homotypic+endoplasmic+reticulum+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).</li>
<li>Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+the+GTPase+atlastin+requires+a+conserved+c-terminal+cytoplasmic+tail+and+dimerization+through+the+middle+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+atlastin+GTpase+provide+insight+into+homotypic+fusion+of+endoplasmic+reticulum+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).</li>
<li>Byrnes, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+conformational+switching+and+GTP+loading+of+the+large+g+protein+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin.</a> EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).</li>
<li>Byrnes, L. J., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+nucleotide-dependent+dimerization+of+the+large+g+protein+atlastin-1%2Fspg3a%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).</li>
<li>Morin-Leisk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intramolecular+salt+bridge+drives+the+soluble+domain+of+gtp-bound+atlastin+into+the+postfusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation.</a> J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).</li>
<li>Pendin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+packing+of+a+three-helix+bundle+is+required+for+atlastin-mediated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).</li>
<li>Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crossover+conformational+shift+of+the+GTPase+atlastin+provides+the+energy+driving+ER+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion.</a> J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+yeast+dynamin-like+GTPase+sey1p+provide+insight+into+homotypic+er+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion.</a> J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).</li>
<li>Rizo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release.</a> Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).</li>
<li>Gao, S., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion%3A+The+machineries+in+and+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion: The machineries in and out.</a> Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).</li>
<li>Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypervariable+region+of+atlastin-1+is+a+site+for+intrinsic+and+extrinsic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation.</a> J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).</li>
<li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR-mediated+beta-arrestin+activation+deconvoluted+with+single-molecule+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision.</a> Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+translocation+underlying+chromatin+remodelling+by+snf2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2.</a> Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+dynamin-like+MXA+revealed+by+single-molecule+fret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret.</a> Nat Commun. 8, 15744(2017).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+mechanism+of+atlastin-mediated+homotypic+membrane+fusion+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level.</a> Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).</li>
<li>Guelly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high-throughput+sequencing+identifies+mutations+in+atlastin-1+as+a+cause+of+hereditary+sensory+neuropathy+type+i%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i.</a> Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).</li>
<li>Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+CRISPR%2FCas9+induced+atlastin+pathological+mutations+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila.</a> Front Neurosci. 14, 547746(2020).</li>
<li>Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+network+formation+and+membrane+fusion+by+atlastin1%2Fspg3a+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+newly+identified+GTPase+gene+cause+autosomal+dominant+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia.</a> Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מסננים צנטריפוגליים 10 K</td><td>Amicon</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>45 טי רוטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>532 ננומטר לייזר</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>640 ננומטר לייזר</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 K MWCO עמודי התפלה ספין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5-טריפוספט מלח דיסודיום (ATP)</td> <td>רוש</td><td>11140965001</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בנזואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>242381</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-PEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td>170-124</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ביוטיניל שלו</td><td>נוגדנים Bioss</td><td>bs-0287R-bio</td><td></td></tr><tr><td>d-biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז נטול EDTA רוש</td><td></td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת EMCCD</td><td>Andor</td><td>IX897</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5&פריים;-מלח נתרן דיפוספט (תמ"ג)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; G7127</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5'-O-[גמא-תיו]טריפוספט (GTP&gamma; S)</td> <td>Roche</td><td>10220647001</td><td></td></tr><tr><td>מטרת טבילת שמן עם צמצם מספרי גבוה</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon, 100x, NA 1.49, טבילת שמן</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://imagej.net/ij/ Isopropyl-&Beta;-D-Thiogalactoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LD555-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית אשלגן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום אצטט טטרהידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.mathworks.com/ זכוכית כיסוי מיקרוסקופ</td><td>Fisherbrand</td><td>18834</td><td>&nbsp;( 24 מ"מ ופיתו; 60 מ"מ)</td></tr> <tr><td>שקופיות</td><td></td><td></td> מיקרוסקופ <td>מותאמות אישית, (75 מ"מ ופעמים; 26 מ"מ ופעמים; 1 מ"מ) עם 6 זוגות חורים בקוטר 1.2 מ"מ</td></tr><tr><td>mPEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td>170-106</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast</td><td>Flow Cytiva</td><td>17531802</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>Origin תוכנה</td><td></td><td>https://www.originlab.com/</td></tr> <tr><td>חלקיקי פוליסטירן</td><td>QDSphere</td><td>AG1265</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-dioxygenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610492</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 עלייה (10/300 GL)</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ TIRF</td><td>Nikon</td><td>Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)פוספין הידרוכלוריד (TCEP)</td><td>Thermo</td><td>75259</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיית fret של מולקולה אחת להתבוננות בדינמיקת הקונפורמציה של gtpase atlastin דמוי דינמין

Single-Molecule FRET Imaging for Observing the Conformational Dynamics of Dynamin-Like GTPase Atlastin

ניסויי smFRET בוצעו במיקרוסקופ TIRF על ידי לכידת עוצמת הקרינה של פלואורופורים כל 30 אלפיות השנייה. תמונות מייצגות של מולקולותציטו ATL1 המסומנות על ידי LD555 (תורם) ו/או LD655 (מקבל) בהיעדר או נוכחות של נוקלאוטידים שונים מוצגות באיור 2A-C. עוצמות הקרינה של שני הפלואורופורים על חלקיקים בודדים נרשמו, וחולצו מאות מסלולי FRET המציגים תכונות אופייניות של מולקולה בודדת. העקבות המייצגות מוצגות באיור 2D-F<stro...

הדמיית FRET של מולקולה אחת להתבוננות בדינמיקת הקונפורמציה של GTPase Atlastin דמוי דינמין

The rigid-body rotation of the three-helical middle domain (3HB) relative to the GTPase domain of dynamin-like protein atlastin (ATL) is a crucial driver ...

single-molecule-fret-imaging-for-observing-conformational-dynamics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את TIRF, טכניקה מבוססת מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת להמחשת דינמיקת פילמור אקטין ומיקרוטובול. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול בזמן אמת, החיונית להבנת שיחות צולבות תאיות.

מיקרוסקופ TIRF להמחשת דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול

יכול להיות מקומי fluorophores יחיד עם דיוק ננומטר באמצעות פיונה. הנה סיכום של טכניקת FIONA מדווח, וכיצד לבצע את ניסויי FIONA מתואר.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לצלם ולכמת ישירות את התנועה של מנחת מסוקים Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) המסומן באופן פלואורסצנטי ומשוחזר במלואו על מולקולות דנ"א ליניאריות המוחזקות במקומן במלכודת אופטית.

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

למד את הדינמיקה הקונפורמציונלית של חלבון Atlastin במהלך מחזור הידרוליזת GTP באמצעות smFRET. שיטה זו מאפשרת מעקב מדויק אחרי שינויי מבנה חלבונים ברמת מולקולה בודדת.

הדמיית FRET של מולקולה אחת להתבוננות בדינמיקת הקונפורמציה של GTPase Atlastin דמוי דינמין

גלה סרטונים נוספים