הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים בוורידים מזנטריים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני

תפקידם של גנים מסוימים על הופעת והתפתחות פקקת, במקרה זה, אנו חוקרים את ביטוי PAR1 האנדותל על פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה. אנו מנסים לאתר את השפעת האנדותל על התגובה, הן לאחר איסכמיה והן במהלך רפרפוזיה. היבט חשוב באמת שלא נחקר עד כה הוא לאתר את התפקיד של קומנסלים במעיים בפגיעה איסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית.

כדי לחקור את השאלה הזו, הקבוצה שלנו שילבה מיקרוסקופ תוך-חיוני עם מודל פגיעה באיסכמיה מזנטרית-רפרפוזיה, ושילבנו זאת עם מודלים של עכברים נטולי חיידקים. יישום מודלים של פקקת על עכברים טרנסגניים בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך חיונית, טכנולוגיות כאלה מאפשרות תצפית in vivo של התנהגויות תאיות במהלך התפרצות המחלה. ביצוע מודלים ניסיוניים על אורגניזמים חיים הוא תמיד אתגר, שכן הניסוי מושפע מגורמים רבים כולל מין, גיל, טיפול בהרדמה, שינויים בתקנות רווחת בעלי חיים וכו '.

כמו כן, המחקר בפקקת החל במאה הקודמת. גורמים תורמים רבים עדיין לא נפתרו. הקבוצה שלי חוקרת את התפקיד של מיקרוביוטת המעי על פקקת, טרשת עורקים, תפקוד טסיות הדם וכלי דם.

כדי להתחיל, מקם את העכבר המרדים והמגולח בשכיבה גבית על כרית חימום. חבר את העכבר למערכת החמצן באמצעות חרוט אף. הצמידו את גפי העכבר לכרית המחוממת בעזרת סרט ניתוח.

להשתלת הצנתר בווריד הצוואר, בצע חתך רוחבי מעל קנה הנשימה. הסר את העור המכסה את הצוואר ובודד את וריד הצוואר הימני. לאחר מכן, באמצעות חוט משי של חמישה סנטימטרים, לסגור את הקצה הדיסטלי של הווריד ולתקן אותו עם מלקחיים כירורגיים.

מניחים שלושה חוטי משי כשני סנטימטרים מתחת לווריד, אחד ליד הקצה הדיסטלי, ושניים ליד הקצה הפרוקסימלי של הווריד הצווארי. לקשור קשר כירורגי, אבל לא לסגור את כלי השיט. מלאו צנתר פוליאתילן בנתרן כלורי 0.9%.

הסר בועות אוויר וחבר אותו למזרק של מיליליטר אחד. השתמש במספריים כדי לחתוך חור בין הקשר השני והשלישי ולהשתיל את הצנתר לתוך הווריד הצווארי. שאפו את המזרק כדי לוודא שהדם נמצא בצנתר.

קשרו את חוט המשי כדי לאבטח את הצנתר בווריד. לאחר מכן, השתמש בסרט רפואי כדי לאבטח את המזרק. ממלאים מזרקים של מיליליטר אחד בתפוז אקרידין בריכוז סופי של 0.5 מיליגרם למיליליטר וצבע חומצת גרעין בריכוז של חמישה מיקרומולרים.

הזריקו 50 מיקרוליטר של SYTOX Orange עבור מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות, או NETs. יש לחטא את עור הבטן של העכבר בסיבובים מתחלפים של פילינג על בסיס יוד ואלכוהול. לאחר מכן, באמצעות אזמל, לבצע laparotomy שלושה עד חמישה סנטימטרים לאורך אלבה ליניארית.

מקמו בעדינות את המעי מחוץ לחלל הבטן באמצעות שני קצוות כותנה לחים במי מלח וזהו מיקום עם כיסוי שומן מינימלי. מקם ענפים קטנים של המעי על בצק שחור כדי להפחית את אות הרקע. להזריק 50 מיקרוליטר של כתום acridine דרך קטטר הווריד jugular כדי לדמיין את leukocytes מוכתם.

לרכוש את הווידאו של המעי לפני איסכמיה reperfusion. מכינים דחיסה רטובה עם נתרן כלורי ומניחים את המעי בו. לחסום את העורק mesenteric העליון עם מהדק כלי דם קטן.

דחפו בעדינות את המעי חזרה לחלל הבטן באמצעות צמר גפן לח במי מלח. השתמש בתפר 7-0 כדי לסגור את דופן הבטן ולמנוע אובדן לחות וטמפרטורה. לאחר שעה, הסר את התפר.

לאחר התקופה האיסכמית, יש למרוח כמה טיפות מי מלח על האזור החתוך. לאחר מכן, הסר בעדינות את האטבים המיקרו-וסקולריים באמצעות יישום קליפס. בעזרת קצות כותנה לחים במי מלח, מקמו בעדינות את המעי שוב מחוץ לחלל הבטן ומקמו את הענפים הקטנים של הווריד על בצק שחור.

להזריק 50 מיקרוליטר של כתום acridine וללכוד את הווידאו פוסט-איסכמי של הווריד. הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי רחב השדה במהירות גבוהה המצויד במעבה למרחקים ארוכים, מונוכרומטור, יעד טבילה במים פי 10 ומצלמת מכשיר מצומדת טעינה. הגדר את זמן החשיפה ל- 30 אלפיות השנייה ובחר את ערוץ 5B עם המסננים Alexa Fluor 488 ו- Rhodamine Red המותקנים כדי לדמיין את הלויקוציטים וה- NET.

כמת גיוס תאים בתוך אזור עניין של 0.06 מילימטר מרובע. לאחר מכן, כמת לויקוציטים דבקים על ידי ספירת תאים שנותרו נייחים או מחוברים לרירית האנדותל במהלך תקופת תצפית של 20 שניות. זהה NETs המסומנים הן עם לויקוציטים והן עם צבעים פלואורסצנטיים של חומצת גרעין.

הידבקות לויקוציטים לאנדותל המזנטרי האיסכמי עלתה הן בקבוצות מסוג בר והן בקבוצת דלתא EC מסוג F2r בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה, עם הדבקה נמוכה יותר באופן בולט שנצפתה בקבוצת F2r Delta EC, מה שמרמז על תפקיד של PAR1 אנדותל בגיוס לויקוציטים. לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה, נצפו NETs רק בקבוצה מסוג פרא המבטאים רמות נורמליות של PAR1 על תאי האנדותל, מה שמצביע על תפקיד רגולטורי של PAR1 ב- NETosis.