שימוש ב-R, Seurat ו-CellChat כדי לנתח מערך נתונים של טרנסקריפטומיקה של תא בודד של ריפוי פצעי עור של עכבר

במעבדה שלנו, אנו משתמשים בכלים מתפתחים כגון טרנסקריפטומיקה של תא בודד ותעתיק מרחבי עם גישות ביולוגיה מערכתית וביואינפורמטיקה כדי לחקור את הדינמיקה התאית המרחבית של תוצאות ריפוי דיפרנציאלי. בשנים האחרונות אנו עדים לאימוץ מהיר של טרנסקריפטומיקה של תא בודד לחקר ריפוי פצעים בבני אדם ובאורגניזמים מודלים, כגון עכברים. הניתוח המלא של מערכי נתונים של תא בודד אוסר על מדעני ספסל עם ניסיון מועט או ללא ניסיון בביואינפורמטיקה. המשמעות היא שלעתים קרובות מדי, מערכי נתונים של תא בודד אינם מנוצלים מספיק על ידי מדענים בתחום ריפוי פצעים. זהו הפרוטוקול המקיף הראשון שאינו מניח ניסיון קודם בביואינפורמטיקה, שלוקח את המשתמש כל הדרך מהורדת מערך הנתונים ועד לפלט של ניתוחים רלוונטיים בהקשר של מחקר ריפוי פצעים. הפרוטוקול שלנו צריך לשמש כתבנית לחוקרי ריפוי פצעים לנתח באופן מלא יותר את מערכי הנתונים של התא הבודד שלהם ולהיות מסוגלים לחלץ תובנות חדשות ממערכי נתונים זמינים לציבור.

[שלין] כדי להתחיל, נווט אל קבצי מערך הנתונים ממאגר אומניבוס ביטוי הגנים באמצעות מספר ההרשמה GSE204777. לחץ על מערך הנתונים הראשון שכותרתו GSM6190913. גלול לתחתית דף GSM6190913 והורד את שלושת הקבצים הרשומים באמצעות קישורי FTP או HTML. באמצעות סייר הקבצים של המחשב, העבר את הקבצים שהורדת לספרייה בשם b1, וודא שהוא ממוקם בתוך ספריית העבודה. אחזר את פרטי נתיב הספריה עבור קבצי הרצף של תא בודד שהורדו. כעת, טען את קבצי הרצף של תא בודד לסביבת העבודה. לאחר מכן, הפרד את ביטוי הגנים וריבוי נתוני HTO ממערך הנתונים העובד. צור אובייקט Seurat באמצעות נתוני ביטוי הגנים תוך סינון גנים שזוהו בפחות מחמישה תאים ותאים עם פחות מ-200 גנים. עבור מערכי נתונים חסרי נתוני HTO, צור את אובייקט Seurat עם אותם פרמטרי סינון, ועבור לבדיקת ביטוי הגנים. חשב את אחוז הגן המיטוכונדריאלי בכל תא והקצה ערך זה כמשתנה מטא נתונים. דמיין את התפלגות ספירת הגנים, סך ה-RNA ואחוז הגנים המיטוכונדריאלי על פני כל התאים. הסר תאים עם תוכן מיטוכונדריאלי העולה על 25% באמצעות סף ודמיין את ההתפלגות המעודכנת לאחר סינון התאים באיכות נמוכה אלה. זיהוי כפילויות סבירות באמצעות שיטת איתור הכפילים של SC. הפעל את צינור איתור הכפילים של SC באמצעות הפקודות והקצה את ציוני הכפילים המתקבלים כמשתנה מטא נתונים חדש. כעת, דמיין את התפלגות הציונים הכפולים על פני כל התאים. הסר את כל התאים עם ציונים כפולים מעל 0.25 ושמור את אובייקט Seurat הנקי כקובץ RDS בספריית העבודה. בצע נורמליזציה של נתונים, קנה מידה וניתוח רכיבים עיקריים. הצג באופן חזותי את תרומת השונות על פני 50 הרכיבים העיקריים הראשונים. אשכול את התאים באמצעות 13 הרכיבים העיקריים הראשונים ורזולוציית אשכולות של 0.1. בצע קירוב והקרנה אחידים של סעפת, או הפחתת UMAP בניתוח שכנים, תוך שימוש ב-13 מרכיבי העיקרון הראשונים והגדר את מספר הזרע ל-123. כעת, דמיין אשכולות תאים בעלילת UMAP, ואחריו הערות זמן ומרחב פצועות בעלילת UMAP. לאחר מכן, צור טבלה המשייכת אשכולות תאים עם הערות זמן ומרחב פצע. קבע זהויות של סוגי תאים עיקריים לאחר חישוב גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין כל האשכולות והקצה את רשימות ה-DEG המתקבלות למשתנה לפני שמירתן כקובץ טקסט מופרד בספריית העבודה. כעת, פתח את קובץ סמני אשכול מערך הנתונים ביישום גיליון אלקטרוני. השתמש באשף ייבוא הטקסט כדי להגדיר את הפסיק כמפריד ולעצב עמודות של שמות גנים כטקסט כדי למנוע המרה אוטומטית של שמות גנים לתאריכים. בגיליון אלקטרוני, דרג את עמודת ה-FC הממוצעת של יומן שני מהגדול ביותר לקטן ביותר כדי לסדר את השורות על-ידי הקטנת ערכי שינוי כפול של יומן, ואחריו עמודת האשכול מהקטנה ביותר לגדולה ביותר. כדי לסדר את השורות על-ידי הגדלת מספרי אשכול Seurat, סנן את העמודה הממוצעת של יומן שני FC כך שתכלול רק ערכים גדולים או שווים ל- 2.5 ולאחר מכן סנן את עמודת PCT 1 כך שתכלול ערכים גדולים או שווים ל- 0.4. לאחר מכן, סנן את העמודה PCT 2 כך שתכלול ערכים קטנים או שווים ל- 0.2. לבסוף, סנן את העמודה המותאמת לערך P כך שתכלול ערכים קטנים או שווים ל- 0.01. כעת, פתח את כלי ניתוח ההעשרה מבוסס האינטרנט של Enrichr. עבור כל אשכול, העתק את רשימת הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי לחלון Enrichr נפרד ולחץ על ניתוח. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה סוגי תאים מעל פלט הניתוח והתמקד בחמשת ההעשרה המובילה בשלושת מסדי הנתונים של סמני התאים שנאספו. בהתבסס על ההעשרה העליונה מניתוח Enrichr, הקצה זהויות סבירות לשמונת האשכולות. שלב אשכולות שניים ושש לביאור יחיד שכותרתו פיברובלסטים, והקצה את ההערות הללו כמשתנה מטא נתונים חדש בשם סוגי תאים. לאחר מכן, דמיין את סוגי התאים המבוארים בעלילת UMAP והצג את הלוקליזציה של גני סמני האשכול העליונים המודגשים בסדרה של עלילות UMAP. דמיין את סמן האשכול העליון המתבטא באופן דיפרנציאלי בתרשים נקודות המקובץ לפי מספרי אשכול מקוריים, ולאחר מכן את גני הסמן העליונים שוב בתרשים נקודות, הפעם מקובצים לפי סוגי תאים מוערים. כדי להתכונן לניתוח סדרות זמן, הסר הערות מרחביות ופשט את מערך הנתונים. הקצה מחדש את המטא-נתונים של זמן ומרחב הפצע למשתנה חדש שנקרא DPW עבור ימים לאחר פציעה. דמיין את קיבוצי קורסי הזמן החדשים של DPW בתרשים UMAP וצור טבלאות המציגות את מספר התאים מכל סוג בתוך כל קבוצת DPW. לאחר מכן, המר את ספירת התאים לפרופורציות כדי להעריך שינויים יחסיים בהרכב סוג התא במהלך הריפוי ולדמיין את הפרופורציה של כל קטגוריית DPW בתוך כל סוג תא. לבסוף, דמיין את הפרופורציה של כל סוג תא בתוך כל קבוצת DPW ושמור את אובייקט Seurat הסופי המכיל את כל ההערות והמסננים כקובץ RDS בספריית העבודה. כל התאים במערך הנתונים התקבצו באופן מובהק לסוגי תאים מקודדים בצבע עיקריים בעלילת ה-UMAP, המאשרים הערות מוצלחות המבוססות על חתימות סוג תאים מועשרות. ביטוי גבוה של גנים של סמני אשכול עליונים היה ממוקם בתוך אשכולות סוג התא שלהם בחלקות ה-UMAP. הדמיית תרשים נקודות אישרה שרמות הביטוי הגבוהות ביותר של גנים של סמני אשכול הוגבלו לסוגי התאים העיקריים המבוארים שלהם. תרשים העמודות המוערם גילה כי נויטרופילים ומקרופאגים היו דומיננטיים ביום הראשון לאחר הפציעה, בעוד שפיברובלסטים, תאי אפיתל ואנדותל הפכו נפוצים יותר בנקודות זמן מאוחרות יותר, מה שמשקף את המפל התאי הידוע של ריפוי פצעים.