Name: אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: למדו שיטת אבלציה בלייזר דו-פוטוני לחקירת התחדשות עצם ותגובת החיסון בזחלי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של תהליכי הריפוי והשפעת מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול המחקר קיבל אישור מ- Landesdirektion Sachsen, מספרי היתר 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. זני דגי הזברה שבהם נעשה שימוש נשמרו על פי החוק הלאומי ובתנאים סטנדרטיים כפי שתואר קודם לכן27,28. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת חומרים ופתרונות
<ol><li>שמור על העוברים במדיה E3 1x. הכן את המדיה 1x E3 על ידי דילול 170 מ"ל של ציר 60x E3 ב 10 L של מים deionized והוספת 2 מ"ל 0.1% methylene כחול.<ol><li>הכן את מלאי המדיה 60x E3 על ידי ערבוב 17.2 גרם של NaCl, 0.76 גרם של KCl, 2.90 גרם של CaCl2·2 H2O, 4.90 גרם של MgSO4·7 H2O ב 1 L של מים autoclaved deionized.</li>
	</ol></li>
	<li>להטמעת הזחלים הכינו מראש אליציטוטים של אגרוז 1% נקודת התכה נמוכה (LMA) ושמרו אותם בטמפרטורת החדר.<ol><li>כדי להכין aliquots, להמיס LMA במדיה 1x E3, למשל, 500 מ"ג של LMA ב 50 מ"ל של 1x E3 בבקבוק Erlenmeyer, לחמם את התמיסה במיקרוגל עד agarose מתמוסס לחלוטין, ולחלק אותו לתוך 1 מ"ל aliquots בצינורות 1.5 מ"ל.</li>
	</ol></li>
</ol>2. גידול דגי זברה ואיסוף עוברים
הערה: זחלי זברה טרנסגניים כפולים המדווחים על נוכחות אוסטאובלסטים מחויבים [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 ומקרופאגים [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] שימשו כאן30 (איור 1A).
<ol><li>הציבו דגי זברה הוריים עם הטרנסגנים היחידים הרצויים בכלובי הזדווגות סטנדרטיים בערב שלפני ההזדווגות. הערה: כלובי הזדווגות סטנדרטיים מאפשרים לביצים לעבור לתא תחתון שבו דגי הזברה ההורים אינם יכולים להגיע אליהן.<ol><li>יש להפריד בין זכרים לנקבות עד להזדווגות באמצעות מחיצה בכלוב ההזדווגות. הסר את המחיצה בבוקר של היום הבא כדי להתחיל הזדווגות.</li>
	</ol></li>
	<li>בצהריים, לכל המאוחר, מוציאים את דגי הזברה ההוריים ממכלי הרבייה ואוספים את העוברים, תוך שהם מסננים את המים מכלוב ההזדווגות דרך מסננת. הערה: במקרה שהגיל המדויק של הזחלים הוא הקובע, קצרו עוברים במרווחי זמן קבועים של כ-30 דקות. יש להשתמש בבני זוג למצמד בניסויים עם קבוצות ניסוי שונות.</li>
	<li>הניחו את העוברים בכלי בקוטר 100 מ"מ המכיל מדיה E3 1x ושמרו אותם באינקובטור בטמפרטורה של28°C 31.</li>
	<li>הסר ביצים לא מופרות ועוברים מתים מהצלחת באמצעות פיפטה פלסטיק בעזרת סטריאומיקרוסקופ ושנה מדיה E3 1x מדי יום.</li>
	<li>לפני הניסוי, מיין זחלים חיוביים עבור טרנסגנים הכתב באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>3. הטמעת זחלים באגרוז נמס נמוך
<ol><li>להמיס LMA aliquots ב thermoblock או אמבט מים ב 65 ° C. ברגע שה-LMA נמס, שמרו אותו בטמפרטורה של 42°C עד להטמעה (איור 1B). הוסף 50 μL של 0.4% MS-222 ל- 1 מ"ל המומס של LMA aliquot כדי להשיג ריכוז MS-222 של 0.02% להרדמה.</li>
	<li>הרדימו 4 dpf (ימים לאחר ההפריה) זחלים (או זחלים מבוגרים יותר) במדיה 0.02% MS-222 E3.</li>
	<li>העבירו את הזחלים המורדמים לצלחת מיקרווול עם תחתית זכוכית באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק בנפח 3 מ"ל והוציאו את עודפי המדיה E3 עם אותה פיפטה (איור 1B). הימנעו מהתייבשות הזחלים. הערה: ניתן להטמיע יותר מזחל אחד בצלחת בו זמנית; מומלץ להטמיע 3 עד 5 זחלים כדי לאפשר מספיק זמן למיקום.</li>
	<li>קחו את אגרוז ה-LMA המומס מאמבט המים / תרמובלוק והוסיפו טיפה (מקררת) של LMA לצלחת, תוך כיסוי תחתית הזכוכית שבה מוקמו הזחלים. שימו לב שה-LMA לא חם מדי אבל עדיין נוזלי.</li>
	<li>לאחר מכן, מניחים את הזחלים במצב הרוחבי הרצוי לפני שהאגרוז מתמצק. כאן, ודאו תנוחה צידית שבה האופרקל קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית של הצלחת כהכנה למערך המיקרוסקופ ההופכי (איור 1B).</li>
	<li>הניחו לאגרוז להתמצק ולאחר מכן הוסיפו מדיה E3 (המכילה מקסימום 0.02% MS-222) לצלחת כדי למנוע התייבשות של האגרוז (איור 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של הליך ההטבעה. (A) Tg מהונדס כפול (osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 זחלי דגי זברה עם אוסטאובלסטים אופרקולריים מסומנים בירוק ומקרופאגים המסומנים באדום. (ב) זרימת העבודה של הליך ההטבעה, כמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. הדמיה In vivo של הזחלים ואבלציה בלייזר
<ol><li>לאוסטאובלסטים בלייזר באופרקל המתפתח של דגי זברה טרנסגניים Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, השתמש במיקרוסקופ הפוך לסריקת לייזר עם שני פוטונים עם מטרת מים 25x/0.95 או מערך שווה ערך.</li>
	<li>מניחים את המנה עם הזחלים המשובצים על הבמה המיקרוסקופית במיקרוסקופ ההפוך וממקמים את האזור הרצוי לאבלציה במרכז שדה הראייה. ניתן לזהות בקלות את האופרקל בעזרת האות הפלואורסצנטי GFP.</li>
	<li>לאחר שהאופרקל ממוקד וממורכז בשדה הראייה של המיקרוסקופ, בחר את הגדרות מחסנית z (לעתים קרובות נעשה שימוש במרווחי z של 1-2 מיקרומטר) כדי לצלם את כל רוחב האופרקל. יחד עם זאת, בחר את האזור במישור z ספציפי להיות ablated (בדרך כלל באזור האחורי של האופרקל). אבלציה של לייזר דו-פוטוני מופעלת רק במישור זה. הערה: רזולוציה גבוהה יותר בממד z תוביל לזמני הדמיה ארוכים יותר, אך תאפשר ניתוח נפחי של הנתונים שנרכשו מאוחר יותר.</li>
	<li>דמיינו את אזור העניין של האופרקל לפני אבלציה. עבור זיהוי GFP, השתמש בלייזר אור לבן ב- 488 ננומטר וגלאי היברידי הנע בין 495 ננומטר ל- 550 ננומטר או שווה ערך. דמיינו את המקרופאגים באמצעות עירור של 555 ננומטר (לייזר אור לבן), עם טווח זיהוי mCherry של 595 עד 780 ננומטר על גלאי היברידי (או שווה ערך).<ol><li>השתמש בפורמט התמונה 512 x 512 לקבלת יחס איכות / זמן טוב (ניתן להשתמש בפורמטים אחרים אם רוצים רזולוציה גבוהה יותר או לחילופין מהירות גבוהה יותר). הערה: ניתן להשתמש באינקובטור מבוקר טמפרטורה המותקן במיקרוסקופ ולכוונן, למשל, ל -28 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>צייר אזור מעגלי בקוטר של 25 מיקרומטר (ניתן לבחור צורות וגדלים אחרים בהתאם לניסוי) במישור דו-ממדי נבחר, תוך מיקוד האופרקל באמצעות הכלי החזר השקעה.</li>
	<li>כדי לבצע את האבלציה, יש להפעיל עוצמת אבלציה (נמדדת ללא מטרה) ב-450 mW ולחשוף את האזור שנבחר ללייזר דו-פוטוני במהירות סריקה של 400 הרץ ומשך כולל של 10 שניות. במהלך אבלציה, ניתן לדמיין את האזור באמצעות גלאי היברידי בטווח של 401-443 ננומטר או שווה ערך.</li>
	<li>לאחר אבלציה, אשר את האבלציה מבחינה מבנית על ידי הדמיה שוב של אותה מחסנית z עם אותן הגדרות שבהן נעשה שימוש לפני האבלציה. האזור האבלאט אינו מכיל יותר תאים פלואורסצנטיים.</li>
</ol>5. התאוששות הזחלים והדמיה למעקב אחר גיוס תאי מערכת החיסון
<ol><li>אם יש צורך לבצע את ההדמיה של גיוס תאי מערכת החיסון באיחור, יש לשחזר את הזחלים מההדמיה ומההרדמה. הסר את הזחלים בזהירות מה- LMA באמצעות מלקחיים או מחט דיסקציה.<ol><li>ראשית, להסיר שכבה של agarose המכסה את הזחלים. שנית, הסר את האגרוז במגע ישיר עם הזחלים. השמיט שלב זה אם מתרחש הדמיה מיידית של גיוס תאי מערכת החיסון.</li>
	</ol></li>
	<li>החזירו את הזחלים לצלחת עם מצע E3 טהור ובדקו את התאוששותם. ההתאוששות ניכרת על ידי שחייה של הזחלים.</li>
	<li>ב 4 או 6 hpl (שעות לאחר הנגע), צלם שוב את אזור האופרקל באמצעות אותן הגדרות באותו מיקרוסקופ כדי לבדוק את ההשפעות של אבלציה על גיוס מקרופאגים. לשם כך, חזור על ההטבעה (שלב 3) וההדמיה כפי שבוצעו קודם לכן (שלב 4).</li>
	<li>לאחר ההדמיה, הסר את הזחלים מה- LMA. הקרבת הזחלים יכולה להתבצע על ידי דגירה במי קרח או עם מנת יתר של MS-222 ב- E3, בהתאם לדרישות החוק. לאחר מכן ניתן להשתמש בדגימות למחקרי מעקב או להיפטר מהן.</li>
</ol>6. ניתוח תמונות וניתוח סטטיסטי
<ol><li>עבד את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כגון פיג'י32. בהתאם לרזולוציית z של הנתונים שנרכשו, ניתן לבצע ניתוחים בדו-ממד או בתלת-ממד.</li>
	<li>כמת את המקרופאגים באופן ידני על ידי הכללת תאים נפרדים בבירור, כגון על ידי הבחנה בגופי התא הראשיים, או לחילופין כימות תאים עם תווית גרעינית או על ידי מדידת השטח במקרה שהתאים חופפים (השלב הבא).</li>
	<li>לכימות האזור, צרו מסיכה המקיפה את המקרופאגים. לשם כך, השתמש בכלי Image &gt; Adjust &gt; Threshold וצור החזר השקעה (Analyze &gt; Tools &gt; ROI Manager &gt; Add) בפיג'י. אין לכלול חלקיקים קטנים ברקע לצורך כימות.<ol><li>לאחר מכן, מדדו את השטח (Analyze &gt; Measure). שקול אם אזורים של פלואורסצנטיות תאית חופפת צריכים להיכלל במדידה. הערה: כאן, אזור האבלציה המעגלי הושמט ממדידות השטח מכיוון שלא ניתן להבחין בין מקרופאגים מגויסים באזור זה.</li>
	</ol></li>
	<li>צור גרפים המשרטטים את תוצאות המדידה באמצעות תוכנה מתאימה. כדי להשוות את הנתונים לפני ואחרי אבלציה, בצע בדיקה סטטיסטית מתאימה (כאן, בוצע מבחן t חד זנבי זוגי). הערה: ניתן להכין את האיורים באמצעות תוכנות לעריכת תמונות ועיצוב גרפי.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>שיטת אבלציה בלייזר לחקר התחדשות עצם בזחלי זברה

<ol><li>Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Zebrafish.</a> Dev. 146 (18), dev167692(2019).</li>
<li>Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+biology+and+disease+modeling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal biology and disease modeling in zebrafish.</a> J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).</li>
<li>Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+injury+models+to+study+the+effects+of+prednisolone+in+regenerating+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue.</a> J Vis Exp. (140), e58429(2018).</li>
<li>Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+zebrafish+bone+crush+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A new zebrafish bone crush injury model.</a> Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).</li>
<li>González-Rosa, J. M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoinjury+as+a+myocardial+infarction+model+for+the+study+of+cardiac+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish.</a> Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).</li>
<li>Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+fin+regeneration+after+cryoinjury-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage.</a> Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).</li>
<li>Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+amputated+zebrafish+fin+rays+from+de+novo+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts.</a> Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+production+by+reserved+progenitor+cells+in+zebrafish+bone+regeneration+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance.</a> Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).</li>
<li>Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+osteoblast+ablation+triggers+a+pro-osteogenic+inflammatory+response+regulated+by+reactive+oxygen+species+and+glucocorticoid+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish.</a> Dev. 149 (8), 1998030(2022).</li>
<li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> J Vis Exp. (159), e60966(2020).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845(2011).</li>
<li>Goldstein, A. M., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord+regulates+cardiac+lineage+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).</li>
<li>Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+sonic+hedgehog-a-expressing+cells+during+fin+regeneration+affects+ray+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).</li>
<li>Marshall, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+cell+and+tissue+level+laser+ablation+methods+to+study+morphogenetic+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics.</a> Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+pancreatic+cancer+using+a+cylindrical+light+diffuser%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser.</a> Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).</li>
<li>Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+for+cerebral+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Laser ablation for cerebral metastases.</a> Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).</li>
<li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).</li>
<li>Vogel, A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pulsed+laser+ablation+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues.</a> Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).</li>
<li>Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-based+tumor+ablation%3A+Role+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-based tumor ablation: Role of the immune response.</a> Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).</li>
<li>Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Identification+of+dying+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Identification of dying cells.</a> Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).</li>
<li>Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+tissue+regeneration+by+modulating+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Promoting tissue regeneration by modulating the immune system.</a> Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).</li>
<li>Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+modulate+adult+zebrafish+tail+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration.</a> Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).</li>
<li>Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppressive+and+bone+inhibitory+effects+of+prednisolone+in+growing+and+regenerating+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues.</a> J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).</li>
<li>Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+in+the+regenerating+fin+reflect+tissue+homeostasis+disturbances+in+zebrafish+by+affecting+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol.+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling.</a> Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Breeding+and+Embryo+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+II%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Breeding and Embryo Handling.</a> Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט, CaCl2&middot; H2O</td><td>קארל רוט</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים, PS, 100/20 מ"מ</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>צורת קצה ישרה, 11 ס"מ, 0.05 x 0.02 מ"מ</td></tr><tr><td>פלקון צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מיקרובאר תחתונה זכוכית</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>צלחת 35 מ"מ, כיסוי מס' 1.5, קוטר זכוכית 14 מ"מ,</td></tr><tr><td>לייזר מולטיפוטון Insight X3</td> לא מצופה <td>ספקטרה-פיזיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application</td><td>Suite LAS X, Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>רובד Biozym, אגרוז</td></tr>, <tr><td>מגנזיום גופרתי, הפטאהידרט, MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr>כלובי <td></td><td></td><td>הזדווגות</td><td>זנים רבים, למשל Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי, NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 פלקון&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>מצויד בלייזר מולטיפוטון Insight X3 ותוכנת Leica Application Suite</td></tr><tr><td>מחט ניתוח נירוסטה</td><td>Bochem</td><td>12010</td> מערכת מיקרוסקופ סטריאו <td>140 מ"מ</td></tr><tr><td>SZX16</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מצויד בבסיס תאורת LED SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>ארונות תרמוסטטיים TS - WTW</td><td>xylem</td><td>TS 608/2-i</td><td>לדגירה (עובר)</td></tr><tr><td>העברה פיפטה, 3.5 מ"ל</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 מ"מ, LD-PE, שקוף</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 גרסה 4.7.1.0.</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מצויד במצלמת Axiocam MRm ובתוכנת AxioVision</td></tr></tbody></table>

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

אבלציה בלייזר בוצעה כמצוין בפרוטוקול לעיל. אות ה-GFP של האוסטאובלסטים באזור האבלטים נעלם מיד לאחר אבלציה. כדי לחקור את התגובה של אבלציה אוסטאובלסט במונחים של התגובה החיסונית, נוכחות של מקרופאגים ב 6 זחלי dpf לפני וב 6 hpl היה תמונה. לפני אבלציה, מעט מאוד מקרופאגים נצפו באזור האופרקל10 (איור 2). ב-6 hpl זוהתה הצטברות חזקה של מקרופאגים באזור האופרקל האבלאטד ומספר מוגבר של מקרופאגים בשדה הראייה, כולל האופרקל והאזור שמסביב לאופרקל,10 (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> איור 2: גיוס מקרופאגים ב-6 HPL ב-6 זחלי דגי זברה DPF. אזור אופרקל ללא אבלציה וב 6 hpl. אוסטאובלסטים אופרקולריים מסומנים בירוק, מקרופאגים במגנטה, והעיגול המקווקו מציין את האזור המשופע בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
גיוס מקרופאגים נותח גם ב-4 זחלי dpf עם אופרקלים קטנים בהרבה ב-4 HPL שצפו בתוצאות דומות (איור 3). כימות מספר המקרופאגים (מחוץ לאתר האבלציה המיידי בלייזר) הראה עלייה במסגרת הזמן הנחקרת (4.00 ±-2.37 מקרופאגים לפני אבלציה לעומת 7.00 ±-2.76 מקרופאגים ב-4 hpl) (איור 3B). באופן דומה, שטח המקרופאגים (שנמדד במיקרומטר2, 785.8 מיקרומטר2 ± 723.1 מיקרומטר2 לפני אבלציה לעומת 1553 מיקרומטר2 ± 869.9 מיקרומטר2 ב-4 hpl) גדל (איור 3C). מכיוון שלפעמים קשה להבדיל בין מקרופאגים, מומלץ למדוד את אזור המקרופאגים במקום את מספר המקרופאגים, כפי שנעשה כאן.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> איור 3: גיוס מקרופאגים ב-4 HPL ב-4 זחלי דגי זברה DPF. (A) אזור אופרקל ללא אבלציה וב-4 hpl. אוסטאובלסטים אופרקולריים מסומנים בירוק, מקרופאגים במגנטה, והעיגול המקווקו מציין את האזור המשופע בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (B) כימות מספר המקרופאגים באזור האופרקל ישירות לפני (0 hpl) ואחרי אבלציה (4 hpl). (C) כימות אזור המקרופאגים (לא כולל אתר אבלציה בלייזר). זוג מבחני t חד-זנביים. כל נקודה מייצגת את הנתונים של זחל אחד, והממוצע ± SD מוצג, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

השיטה שהוצגה כאן מהווה פגיעה המדויקת של עוברי דג זברה לחיות עם פעימות ליזר באנרגיה גבוהה ועל ניתוח בדיעבד של פגיעות אלה וההתאוששות שלהם עם זמן. אנו גם מראים איך שכותרת גנטית בודדה או קבוצות של תאי שריר שלד יכולות להיות במעקב בזמן ואחרי ניזק מושרה אור ליזר.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

סרטון זה מתאר את השיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה באמצעות שתי אקסוטומיות לייזר פוטונים וצפייה בהתאוששות אקסונלית מפציעה.

אקסוטומיה של לייזר דו-פוטון: שיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה ולצפות בהתאוששות אקסונלית

מקור: Morsch, M.,  et. al., הפעלת מתח ומוות של תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של לייזר UV קונבנציונלית. J. Vis. Exp. (2017) בסרטון זה, אנו בוחנים את הטכניקה של אבלציה בלייזר UV בעוצמה גבוהה למיקוד מדויק ולימוד של נוירונים בודדים בדג זברה טרנסגני. אנו מדגימים כיצד להכין, לשתק ולדמיין תגובות עצביות, תוך הדגשת הדינמיקה התאית של פציעה והתאוששות.

אבלציה סלקטיבית של לייזר חד-נוירון בזחל דג זברה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

מקור: Muto, A., . אבלציה של אוכלוסייה עצבית באמצעות לייזר דו-פוטוני והערכתה באמצעות הדמיית סידן ורישום התנהגותי בזחלי דג זברה. J. Vis. exp. (2018)} } בסרטון זה,  מודגם הליך אבלציה בלייזר דו-פוטוני, המאפשר הרס סלקטיבי של נוירונים פלואורסצנטיים בזחלי דג זברה משותקים באגרוז. הדמיה ברזולוציה גבוהה לפני ואחרי ההליך מאשרת נזק עצבי יעיל, כפי שנצפה בהיעדר פלואורסצנטיות.

אבלציה עצבית ממוקדת באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית בזחל דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

התפתחות עוברית דורשת תיאום בקנה מידה גדול של תנועת תאים. אבלציה תלת-ממדית של עירור דו-פוטון מאפשרת אבלציה תלת-ממדית מבוקרת מרחבית של קבוצות גדולות של תאים עמוקים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לחקור את התגובה של תאים נודדים באופן קולקטיבי ב vivo להסתבכויות בסביבה המכנית שלהם.

אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחביות באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטון בגסטרולה דג הזברה

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

למדו שיטת אבלציה בלייזר דו-פוטוני לחקירת התחדשות עצם ותגובת החיסון בזחלי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של תהליכי הריפוי והשפעת מערכת החיסון.

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

גלה סרטונים נוספים