Name: מיצוי חד-שלבי וניתוח זימוגרפי של גלטינזות חיידקיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: למדו שיטת מיצוי חד-שלבית לזימוגרפיה של ג'לטינזות חיידקיות פעילות מ-Leptospira באמצעות LC-MS/MS. הפרוטוקול מאפשר זיהוי ביומרקרים לגילוי מוקדם של לפטוספירוזיס ופיתוח מועמדים לחיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Yue, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Biology of the extracellular matrix.</a> J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).</li>
<li>Cabral-Pacheco, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).</li>
<li>Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60K+gelatinase+involved+in+mammary+gland+involution+is+regulated+by+%CE%B2-oestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol.</a> Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).</li>
<li>Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+structures%2C+and+collagen-degrading+mechanisms+of+bacterial+collagenolytic+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+46+kDa+gelatinase+on+the+outer+membrane+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).</li>
<li>Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+folding%2C+purification+and+characterization+of+Escherichia+coli+outer+membrane+protease+OmpT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT.</a> Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+membrane+environments+regulate+enzymatic+behaviors+of+Salmonella+outer+membrane+protease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Bio+Med+Chem+Au%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease.</a> ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).</li>
<li>Sarma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+proteome+analysis+shows+the+abundance+of+histidine+kinase+sensor+protein%2C+DNA+helicase%2C+putative+lipoprotein+containing+peptidase+M75+domain+and+peptidase+C39+domain+protein+in+Leptospira+interrogans+grown+in+EMJH+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium.</a> Pathogens. 10 (7), 852(2021).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+solubilization+and+reconstitution+by+detergents.+Symmetrical+analysis+of+the+two+processes+using+octaethylene+glycol+mono-n-dodecyl+ether%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether.</a> Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).</li>
<li>Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+solubilization+of+lipid+bilayers%3A+a+balance+of+driving+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces.</a> Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Zeug, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+microscopic+methods+for+the+neural+ECM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Current microscopic methods for the neural ECM analysis.</a> Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zymography+analysis+of+proteinase+activity+present+in+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>6-אמינוקפרואיקס</td><td>מרק</td><td>א2504</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; 695092</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; 32201</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; א-3553</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; א-3678</td><td></td></tr><tr><td>ביס אקרילאמיד</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; M7279</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר שבר V (BSA)</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; א-8022</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; ב-8026</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<תת>2</td><td>מרק</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie כחול מבריק</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>דאוקסיכולאט</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Ellinghausen&ndash; מק'קאלו&ndash; ג'ונסון&ndash; האריס (EMJH) בינוני, דיפקו</td><td>&nbsp; דיפקו</td><td>&nbsp; 279410</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>מרק</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>מרק</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>גליצין G8790</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Leptospira interrogans serovar Copenhageni זן Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198)&nbsp;, נשמר במאגר הביולוגי של ICMR-RMRC Portblair</td><td>מתוחזק במאגר הביולוגי של ICMR-RMRC פורט בלייר</td><td></td><td>טמפרטורת גידול אופטימלית 30 מעלות; C</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד M8266</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; 17995-7</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>עמ' 4417&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>הכלי להפרדת לוחות</td><td>וונדר וודגל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור</td><td>תרמו-מדעי</td><td>FIBERLite F15 8x50 cy</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; ל-4396</td><td></td></tr><tr><td>תמד</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; טי-9281</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריזמה (TRIS)&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; סיגמא</td><td>&nbsp; T6066</td><td></td></tr></tbody></table>

מיצוי חד-שלבי וניתוח זימוגרפי של ג'לטינזות חיידקיות

One-step Extraction and Zymographic Analysis of Bacterial Gelatinases

התוצאה מציגה את הזימוגרמה של חלבון לפטוספירלי וג'לטינאזות מסרום אנושי. התוצאות, שמוצגות באיור 1, מייצגות פרוטאזות כפסים לבנים שקופים על רקע כחול. הרצועות מייצגות אזורים בהם הג'לטין הקופולימרי מתפרק ולכן אינו מוכתם, בעוד שאזורים אחרים של הג'ל כולו מוכתמים בכחול בגלל נוכחות הג'לטין. יתר על כן, זה מראה שלמרות שג'לטין הוא גם חלבון, הוא אינו נפלט באלקטרופורזה עקב קופולימריזציה עם אקרילאמיד. זה מראה את החשיבות של קופולימריזציה ושל ההרכב הנכון וזמן מספיק לפילמור.
<p class="jove_content biglegen...

Proteinases of pathogenic bacteria contribute to invasion and pathogenesis by actively degrading the host's extracellular matrix (ECM) components and ...

one-step-extraction-and-zymographic-analysis-of-bacterial-gelatinases

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

פרוטוקול זה מתאר assay פעילות מבוססי לאיתור metalloproteinases מטריקס supernatants תרבות או נוזלי גוף.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

קבוצת ישר קדימה שיטות לבודד לקבוע את זהותו של החלבונים הנפוץ ביותר בא לידי ביטוי בשרירי השלד. אודות 800 נקודות הם להבחין על ג'ל דו מימדי של השריר 10 מ"ג; זה מאפשר להגדרה של ביטוי המגדר חלבון ספציפי. שיטות אלה ייתן תוצאות המקבילה רוב הרקמות.

שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

אנו מתארים את שיטת האבטיפוס לייצור coverslips מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצופה ג'לטין להמחשת הפחתת מטריצת invadopodia בתיווך. טכניקות חישוב באמצעות תוכנה זמינה מוצגות לכימות הרמות כתוצאה של proteolysis מטריצה ​​של תאים בודדים בתוך אוכלוסייה מעורבת וקבוצות תאיות המקיפות את השדות מיקרוסקופים שלמים.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

בסרטון זה אנו מבצעים זימוגרפיה, טכניקה אלקטרופורטית, כדי לנתח את הפעילות הפרוטאוליטית בתוך דגימות ביולוגיות.

Zymography פפטיד פלואורסצנטי: טכניקה שונה לזיהוי פעילות פרוטאז באמצעות מצעים פלואורוגניים בג'ל זימוגרפיה

סרטון זה מדגים את טכניקת אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה כדי להעריך את הפעילות של מטלופרוטאזות מטריצה (MMPs) הקיימות בתרביות תא. ה-MMPs הפעילים מפרקים את המצע הספציפי ל-MMP המוטבע בג'ל פוליאקרילאמיד, המופיע כפסים שקופים על רקע מוכתם כהה לאחר הצביעה.

אלקטרופורזה של ג'ל זימוגרפיה: טכניקה אלקטרופורטית לזיהוי מטאלופרוטאזות מטריקס על ידי הערכת הפעילות האנזימטית

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.

זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

אנלוגים של טרהלוז מתגלים כמולקולות חשובות ליישומים ביולוגיים וביו-רפואיים. אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לסינתזה וטיהור אנזימטית של אנלוגים של טרהלוז שהוא פשוט, יעיל, מהיר וידידותי לסביבה. יישומו לייצור וניהול מהיר של בדיקה לזיהוי מיקובקטריות מודגם.

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

למדו שיטת מיצוי חד-שלבית לזימוגרפיה של ג'לטינזות חיידקיות פעילות מ-Leptospira באמצעות LC-MS/MS. הפרוטוקול מאפשר זיהוי ביומרקרים לגילוי מוקדם של לפטוספירוזיס ופיתוח מועמדים לחיסונים.

מיצוי חד-שלבי וניתוח זימוגרפי של ג'לטינזות חיידקיות

גלה סרטונים נוספים