ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

[מדריך] כדי להתחיל, הכינו אגרוס נקודת התכה נמוכה של 3% במדיום עוברי, חממו את האגרוס לטמפרטורה בטוחה למניפולציה של דגי זברה מבלי לגרום נזק. לפני שהאגרוס מתקרר ומתמצק, מקם זחלים שנמצאים יומיים עד שבעה ימים לאחר ההפריה בצד הגב כלפי מעלה בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית. לאחר שהאגרוס התמצק עם הזחלים במקום, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום עוברי לתבשיל. בעזרת אזמל חותכים את האגרוס לפי הצורך סביב הזחלים. העבירו את צלחת הפטרי עם דג הזברה לבמה של המיקרוסקופ הקונפוקלי. לאחר התאקלמות של 20 דקות, השתמש בהדמיית שדה בהיר כדי למרכז את הדג מתחת ליעד הטבילה במים פי 40 בטמפרטורת החדר. הגדר את פרמטרי רכישת המיקרוסקופ הקונפוקלי על סמך האיכויות ורמות הביטוי של המולקולה הפלואורסצנטית, כמו גם העומק והתכונות האופטיות של הרקמה. התאם את הגדרות עוצמת הלייזר והרווח הראשי כדי ללכוד אור פלורסנט כראוי בטווח האופטימלי ולמנוע אובדן מיותר של פלואורסצנטיות תלויה בהצלחה במחנה G. לאחר מכן מרכז את שדה הראייה על מקבץ עצבי הממוקם בחלק הרוסטרלי של חוט השדרה. בצע סריקת סדרות זמן עם שדה ראייה של 79.86 מיקרומטר מרובע בקצב פריימים של 1.20 פריימים לשנייה ברזולוציה מרחבית של 0.119 מיקרומטר מרובע לפיקסל. התאם את שדה הראייה, הגודל ומהירות הרכישה בהתאם למטרות הניסוי. שתי דקות לאחר תחילת ההדמיה, הוסף 41.67 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אלוורה איזותיוציאנט או מדיום עוברי לצלחת, והמשך להקליט במשך כ-30 שניות כדי לצפות בשינויים בפעילות G Camp 6 באזור העניין באמצעות הדמיית זמן-lapse. אם הפלט המוקלט אינו בפורמט קובץ dot tif, ייצא את קבצי התמונה כקבצי TIF נקודה מחבילת התוכנה של המיקרוסקופ לניתוח פיג'י במורד הזרם. לאחר הורדת תוכנת פיג'י לניתוח עקבות עצביים, פתח את פיג'י, ייבא את קבצי הנקודה CZI לתוכנית. השתמש בכלי המעגל או היד החופשית בפיג'י כדי להדגיש אזור או נוירון מעניין על ידי לחיצה על הסמלים המתאימים. לאחר בחירת אזור העניין או ההחזר על ההשקעה, לחץ על ניתוח, כלים ומנהל החזר ROI מסרגל הכלים של פיג'י. לחץ על הוסף T כדי להוסיף את ההחזר על ההשקעה שנבחר לחלון מנהל ההחזר על ההשקעה. במנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על עוד ורב מדד כדי לנתח את ההחזר על ההשקעה. השאר את ההגדרות כברירת מחדל ולחץ על אישור כדי ליצור נתונים גולמיים. לאחר מכן שמור את הפלט כקובץ CSV להמשך מניפולציה באמצעות Python או גיליונות אלקטרוניים. כעת נרמל את הנתונים הגולמיים כדי לייצג אותם כעקבות עצביים על ידי חישוב ממוצע של 30 השניות האחרונות של הגירוי המקדים של שתי הדקות וליצור עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלת באמצעות הנוסחה הנתונה ולשרטט את הנתונים המנורמלים כעקבות עצביים. מתן אלוורה איזותיוציאנט גרם לעלייה בפלואורסצנטיות G CAMP 6S בתוך אזור מוח מקומי של דג זברה זחל המצביע על פעילות עצבית מוגברת. במהירות לכידה איטית של 0.10 פריימים לשנייה, נוירונים במוח האחורי ובחוט השדרה נראו בבירור ברזולוציה גבוהה. הגדלת מהירות הלכידה ל-0.79 פריימים לשנייה הביאה לאובדן קל של הרזולוציה המרחבית, אך שיפרה את הרזולוציה הזמנית. ב-3.16 פריימים לשנייה, נוירונים נראו פחות מובחנים תוך כדי לכידת דינמיקה זמנית יותר.