הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

מטרת המחקר שלנו היא להבין רשתות מיקרוביאליות בקונסורציום סינתטי הכולל ציאנובקטריה מפרישה סוכרוז ופטריות הטרוטרופיות. בעבר, מיקרוביולוגים חקרו בדרך כלל תרביות טהורות של מיקרואורגניזמים בודדים. בטבע, לעומת זאת, מיקרובים מופיעים בדרך כלל בקונסורציום, ולכן חיוני להבין גם את הרשת המיקרוביאלית בתרביות מעורבות.

אתגר מרכזי אחד הוא למצוא תנאי גידול מתאימים, כולל תווך המאפשר צמיחה של כל חברי המאגדים. כאן אנו מתמקדים בעיקר באופטימיזציה לייצור הסוכרוז וההפרשה הגבוהים ביותר על ידי האיבר הפוטוטרופי, המספק את הבסיס לצמיחה של האיברים ההטרוטרופיים. למעקב אחר צמיחה בתרביות אקסניות, ניתן להשתמש בטכניקות נפוצות כמו צפיפות אופטית או מדידות פיזור אחורי.

עם זאת, טכניקות אלה אינן חלות על תרביות משותפות שבהן אנו זקוקים לספירת התאים של המינים הבודדים. בפרוטוקול שלנו, אנו מיישמים שילוב של תיוג פלואורסצנטי וספירת תאים כדי להבחין בין שותפים שונים לתרבית משותפת. בנוסף, נוכל להראות שניתן להשיג תוצאות דומות בשיטות שונות, החל משיטות פשוטות בעלות נמוכה ועד יקרות ובעלות תפוקה גבוהה.

כדי להתחיל, גלולה את התאים הציאנובקטריאליים לאחר גידול התרבית במשך שלושה ימים. השעו מחדש את הגלולה ב -25 מיליליטר של מדיום CoYBG-11 סטרילי. צנטריפוגה את הדגימה בחום של 4,000 גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט על ידי סילוק. לאחר קביעת הצפיפות האופטית, הוסף את הכמות המחושבת של CoYBG-11 בבקבוק מבולבל של 250 מיליליטר בתנאים סטריליים. לאחר מכן, הוסף את הנפחים המחושבים של תרחיפי התאים הציאנובקטריאליים וההטרוטרופיים כדי להשיג נפח תרבית סופי של 50 מיליליטר.

השתמש ב-50 מיקרוליטר ממלאי ה-IPTG המולארי לתרבית של 50 מיליליטר. לאחר מכן הניחו את הבקבוק בחממת הפוטו בכ-200 מיקרומול פוטונים למטר מרובע לשנייה. השלימו את הסביבה עם 2% פחמן דו חמצני ב-30 מעלות צלזיוס, רעידות מסלוליות ב-150 סל"ד ו-75% לחות.

לדגימה, הוציאו את הבקבוק מהחממה וקחו דגימה של מיליליטר מהתרבות בתנאים סטריליים. כדי להתכונן לכימות המיקרוסקופי, ודא שתא הספירה וזכוכית הכיסוי נקיים מאבק ותאים. מקם את זכוכית הכיסוי בצורה נכונה על ידי החלקתה על שני מוטות התמיכה בלחץ קטן תוך מניעת שבירה.

לאחר שזכוכית הכיסוי ממוקמת כהלכה, התבונן בטבעות של ניוטון בין שני משטחי הזכוכית תוך הקפדה על כך שזכוכית הכיסוי לא תחליק. כעת מערבבים היטב את מתלה התאים ומורחים כמה מיקרוליטרים על קצה החדר. אפשר לתא להתמלא לחלוטין באמצעות כוח נימי.

לאחר מכן השתמש במטרה מתאימה של מיקרוסקופ אור והתמקד בקווי הרשת של תא הספירה. ספור את התאים בריבועים המתאימים לגודל התא הנתון. לכימות על ידי ספירת חלקיקים, התאם את הצפיפות האופטית של הדגימה ל-0.1.

לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר מהדגימה ל-10 מיליליטר של מאגר מדידה איזוטוני. אבטח את המכסה של הדגימה וערבב את הדגימה בעדינות על ידי הטיה קלה של הכוס. לאחר הנחת הדגימה במונה החלקיקים, הכנס נימי עם גודל הנקבוביות המתאים לתאים המנוצלים לתוך הדגימה וסגור את דלת המכונה.

התחל את המדידה ורשום בטווח מתאים. ניתן להבחין בין תאים בגדלים שונים בשלב זה. לכימות על ידי ציטומטריית זרימה של תא בודד, התאם את הצפיפות האופטית של הדגימות כדי לסדר מתאים למדידת ציטומטריה.

החל את הנוסחה הנתונה כדי להבטיח שספירת התאים תישאר בטווח של 1,000 עד 10,000 תאים לשנייה בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה. העבירו 300 מיקרוליטר מכל מתלה תא דגימה לבאר בודדת בצלחת של 96 בארות. לאחר מכן העבירו את צלחת 96 הבארות לדגימה האוטומטית של הציטומטר.

תרשימי נקודות פתוחים והיסטוגרמות עבור ערוצי הקרינה והפיזור הרלוונטיים לדגימות. כדי לקבוע את ריכוז התא, רשום נפח דגימה מוגדר באמצעות פונקציית הרשומה. הפרד את האותות עבור אורגניזמים פוטו-הטרוטרופיים על סמך האוטופלואורסצנציה האדומה של האורגניזם הפוטוטרופי באמצעות ההיסטוגרמה של ערוץ APC-H.

לאחר מכן השתמש בהיסטוגרמה של ערוץ FITC-H המציג רק את האוכלוסייה ההטרוטרופית כדי לזהות את התאים ההטרוטרופיים המכילים חלבון פלואורסצנטי ירוק. השתמש בהיסטוגרמה של ערוץ PC5.5-H כדי להבחין בין תאים הטרוטרופיים המכילים חלבון פלואורסצנטי אדום לבין אלה ללא זה.