חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2D-TAU
18 באוקטובר 2024
שיטה זו מתארת אסטרטגיה פשוטה ומהירה לאפיון וחקירה של פרוטאופורמים של היסטון.
המאמצים שלנו מתמקדים כיום באפיון טוב יותר של המתאם הקיים בין שינויים אפיגנטיים לחיווט מחדש מטבולי, במטרה הסופית לזהות מטרות טיפוליות אפיגנטיות חדשות. בהתחשב באופי הדינמי וההפיך של שינוי אפיגנטי, לאחרונה פותחו מספר תרופות אפי, מה שהוביל לשיפור הטיפול בסרטן ולהפחתת העמידות לכימותרפיה. לאחרונה חלה התקדמות משמעותית בתחום אפיון המופעים, הודות ליישום ספקטומטריית מסה מודרנית, יחד עם טכניקות ההפרדה, כגון עמוד עליון או כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים.
האתגר העיקרי באפיון היסטון הוא, קיומם של פרוטאופורמים היסטונים בלתי ניתנים למנייה, הנובעים מההצלבה בין אנזים דינמי שונה לזמינות מטבוליטים. התחל בהכנת מיני ג'ל TAU למיני ג'ל פוליאקרילאמיד אנכי, מערכת אלקטרופורזה. לשם כך, יש להמיס שש אוריאה מולרית בתמיסה של 15% אקרילאמיד ביס-אקרילאמיד, ומיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד תחת ערבול עדין בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הוסף את שאר הרכיבים והתאם את עוצמת הקול. מלאו את צלחות הג'ל המוגדרות מראש בתמיסה זו, וודאו שלא ייווצרו בועות אוויר, והשאירו 1.5 סנטימטרים מלמעלה. הוסף מיליליטר אחד של איזופרופנול מעל כדי ליישר את הג'ל.
להכנת ג'ל הערימה מתמוסס, ממיסים אוריאה ב-6% אקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד עם מיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד. לאחר הוספת שאר המרכיבים יש למלא את צלחות הג'ל בתמיסה זו ולהכניס מסרק של 10 בארות בין הצלחות עד שהתמיסה מגיעה לאמצע שיני המסרק. לאחר מכן ממיסים שש אוריאה מולארית, חומצה אצטית קרחונית 5% ומים מזוקקים כפולים להכנת 100 מיקרוליטר של מאגר דגימת TAU.
לאחר מכן ממיסים את דגימת ההיסטון הליופילית ב-30 מיקרוליטר של מאגר דגימת TAU. מלאו את המיני קסטה במאגר ריצה של אוניברסיטת תל אביב בריכוז סופי של 5% חומצה אצטית. השתמש במזרק כדי לשטוף את בארות הג'ל עם חיץ רץ, והעמיס את הדגימה לבארות עם מיקרו פיפטה.
לאחר מכן חבר את תא האלקטרופורזה לאספקת החשמל, והניח את האלקטרודה החיובית בתחתית. מדי פעם, כבה את אספקת החשמל ושטוף את בארות הג'ל עם מזרק כדי להסיר בועות מהמשטח התחתון של הג'ל. לאחר הסרת הג'ל מצלחות הג'ל, חותכים את נתיב העניין, בעזרת אזמל נקי.
כעת שטפו את נתיב הג'ל עם 15 מיליליטר של 0.5 M tris hydrochloride, pH 8.8 למשך 15 דקות. הכן 15 מיליליטר של מאגר שיווי משקל אחד ושני, באמצעות הרכיבים המוצגים כאן. לאחר מכן אחסן את מאגר שיווי המשקל השני בחושך.
כעת, דגרו את נתיב הג'ל ב-10 מיליליטר של מאגר שיווי משקל אחד עם תסיסה עדינה למשך 15 דקות, ואז שפכו. לאחר מכן, דגרו את נתיב הג'ל ב-10 מיליליטר של מאגר שיווי משקל שניים תחת תסיסה עדינה למשך 15 דקות בחושך לפני שרוקנים אותו. לאחר מכן, הכינו ג'ל לפתרון אקרילאמיד של 15%, באמצעות ההרכב המוצג כאן.
הגדר את צלחת הג'ל ומלא אותה בתמיסת הג'ל הפתרון, והשאיר 1.5 סנטימטרים מקצה צלחת הג'ל הארוכה. הוסף מיליליטר אחד של איזופרופנול מעל כדי ליישר את הג'ל ולאפשר לו להתפלמר. לאחר שהג'ל התפלמר, שפכו את האיזופרופנול וייבשו את הבאר, בעזרת נייר כרומטוגרפיה תאית של שלושה מ"מ.
הכנס את נתיב הג'ל החתוך לתוך הג'ל המפרסק היטב, בעזרת פינצטה למניעת בועות אוויר, ולאחר מכן אטום את נתיב הג'ל לג'ל המפרס, תוך שימוש בנקודת התכה נמוכה של 0.5% אגרוז בטריס גליצין ובמאגר SDS, עם חמישה מיקרוליטרים של 0.003% ברומופנול כחול. מניחים את צלחות הג'ל בקסטה וממלאים אותן בתריס גליצין ובמאגר SDS. הפעל את הג'ל ב -120 וולט עד שהצבע הכחול ברומופנול מגיע לתחתית.
לאחר הריצה, הסר בעדינות את הג'ל מהצלחות והשליך את עודפי האגרוז. כדי להתחיל, בצע מיני ג'ל טריטון חומצה אוריאה, או אלקטרופורזה של TAU על דגימות היסטון, ולאחר מכן צביעת כסף. לאחר מכן הכינו את הריאגנטים המוצגים כאן.
בעזרת אזמל נקי, הסר נקודות היסטון מעניינות מהג'ל המוכתם, והנח כל נקודה בצינור סיליקון טרי בנפח 1.5 מיליליטר כדי למנוע זיהום צולב איזופורמי. הוסף 250 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 50 מילי-מולרי, או 50% אצטון ניטרו לכל נקודת ג'ל ודגר תחת תסיסה עדינה במיקסר תרמו בטמפרטורת החדר. שפכו את התמיסה וחזרו על תהליך זה שלוש פעמים עד שחתיכות הג'ל נראות שקופות.
כדי לייבש את כתמי הג'ל, הוסף 200 מיקרוליטר אצטון ניטרול. במהלך שלב זה, חתיכות הג'ל יהפכו ללבן אטום. רוקנים את ניטריל האצטון, ומניחים לכתמי הג'ל להתייבש באוויר למשך 10 דקות.
חתיכות הג'ל ייראו יבשות בצינורות. לאחר מכן, החזר לחות לכתמי הג'ל על ידי הוספת 20 מיקרוליטר תמיסת טריפסין או נפח מספיק כדי לכסות את חתיכות הג'ל. דגרו את הצינורות במיקסר תרמו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה למשך ארבע שעות לפחות ועד 16 שעות.
העבירו את הסופרנטנט, המכיל את פפטידי הטריפטיכון לשפופרת טרייה. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי לחתיכות הג'ל וסוניקט פעמיים באמבט מים קולי למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט, המכיל את פפטידי הטריפטיכון הנוספים לאותה שפופרת טרייה.
השתמש בליופילייזר כדי לייבש את הפפטידים המופקים ב-30 מעלות צלזיוס. כדור ליופיליזציה ייווצר בצינור. כעת, הוסיפו 15 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית לכל צינור, ודגרו בעדינות במיקסר תרמו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
העבר את הסופרנטנט לבקבוקון לכרומטוגרפיה נוזלית טנדם ניתוח ספקטרומטריית מסה.
סקירה כללית
שיטה זו מתארת אסטרטגיה פשוטה ומהירה לאפיון ובדיקה של פרוטאופורמים של היסטונים. המיקוד הוא בהבנת המתאם בין שינויים אפיגנטיים לבין ארגון מחדש (rewiring) מטבולי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אפיגנטיקה
- ספקטרומטריית מסות
- טיפול בסרטן
רקע
- שינויים אפיגנטיים הם דינמיים והפיכים.
- סוכני תרופות אפיגנטיים חדשים פותחו כדי לשפר את הטיפול בסרטן.
- פרוטאו-צורות של היסטונים נובעות מהאינטראקציה בין אנזימים ומטבוליטים שעברו שינוי.
- טכניקות מודרניות של ספקטרומטריית מסות משפרות את אפיון ההיסטונים.
מטרת המחקר
- לאפיין פרוטאו-צורות של היסטונים באופן יעיל.
- לזהות מטרות טיפוליות אפיגנטיות חדשות.
- לבחון את הקשר בין שינויים אפיגנטיים למטבוליזם.
שיטות שבשימוש
- הכנת ג'ל TAU מיני לאלקטרופורזה.
- המסה של urea בתמיסת אקרילאמיד.
- שימוש בספקטרומטריה של מסות בשילוב עם טכניקות הפרדה.
- שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC).
תוצאות עיקריות
- הושגה התקדמות משמעותית באפיון היסטונים.
- הבנה משופרת של המתאם בין אפיגנטיקה למטבוליזם.
- פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן.
- אתגרים באפיון היסטונים עקב קיומן של פרוטאו-צורות (proteoforms) רבות.
מסקנות
- אפיון של פרוטאופורמות של היסטונים הוא קריטי להבנת הבקרה האפיגנטית.
- טכניקות מודרניות מאפשרות ניתוח טוב יותר של מודיפיקציות אפיגנטיות.
- מחקרים עתידיים עשויים להוביל לטיפולים חדשניים בסרטן המכוונים לשינויים אפיגנטיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אפיון מקיף של פרוטאו-צורות (proteoforms) של היסטונים הוא קריטי לצמצום סיכונים באימות יעדים אפיגנטיים ולהבנת מנגנוני מחלה המונחים על ידי כרומטין. זרימת העבודה שלאלקטרופורזה בג'ל 2D-TAU מאפשרת העשרה ומיפוי מדויקים של איזופורמים של היסטונים, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של גילוי ומחקר תרגומי. יכולת זו חיונית לקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח הכוללים מודולציה אפיגנטית ובדיקת השערות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של דפוסי PTM של היסטונים להבהרת מסלולי בקרה אפיגנטיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין מודיפיקציות ספציפיות לפרוטאופורמים הקשורות למצבים מחלהיים.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרה באמצעות בידוד ואפיון של איזופורמים חדשים של היסטון.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין דגימות היסטון ברזולוציה גבוהה עבור תהליכי ספקטרומטריה של מסות ו-western blot בהמשך.
- משפר את הניתנות לשחזור ואת הסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי אפשור הפרדה אורתוגונלית של פרוטאופורמים.
- מאפשר ניתוח כמותי של שפע PTM, ובכך תומך בהערכה מהימנה של תרכובות במהלך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים פרופילי PTM של היסטונים למודלים רלוונטיים למחלה כדי לסייע בגילוי סממנים ביולוגיים.
- מספק רצף משלב מיפוי הפרוטאו-צורות (proteoforms) של שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות אפיגנטיות.
- מפחית סיכונים בקידום טרנסלציונלי על ידי אפשור קשר מכניסטי בין PTMs לתוצאות פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף של תהליך הגילוי עד לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת מיפוי ברזולוציה גבוהה של פרוטאופורמות של היסטונים לפני זיהוי מולקולות מובילות ומחקרי תרגום.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות אנליזה מפורטת של PTM.
- סריקה: מספק דגימות היסטון מאופיינות היטב ומוכנות לבדיקה, לצורך אנליזה רב-שלבית הניתנת לשחזור.
- אנליטיקה: מספק תוצרים כמותיים התואמים לספקטרומטריית מסות לצורך אנליזה השוואתית של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מיפוי פרוטאופורמים לתיקוף מודלים של מחלות והתאמה של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה חסונה וניתנת לשימוש חוזר לאפיון PTM של היסטונים במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות אפיגנטיות.
- ערך תפעולי: מייצב את העשרת הפרוטאופורמים והניתוח שלהם עבור תהליכי עבודה הניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וקידום יעיל של תוכניות אפיגנטיות מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מטרות והתערבויות אפיגנטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופורזה של ג'ל, ספקטרומטריה של מסות וטיפול בדגימות פרוטאומיקה.
- מחייב גישה למכשור ייעודי להפרדה של ג'ל דו-ממדי (2D gel) ואנליזה של MS במורד התהליך.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים השונים כדי להבטיח הדירות ויכולת השוואה של הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה למקורות היסטונים שונים או למערכות מודל שונות, בהתאם למורכבות הדגימה.
- קיבולת העיבוד (Throughput) והרגישות מושפעות מרזולוציית הג'ל וממהירויות הספקטרומטריה של המסות.
