Name: חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של גל 2D-TAU (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: למדו איך לאפיין היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזת ג'ל 2D-TAU לזיהוי מטרות תרפויטיות אפיגנטיות חדשות. שיטה זו משפרת את הטיפול בסרטן ומפחיתה עמידות כימותרפית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>הפרדת ג'ל דו-ממדית להעשרת איזופורמים של היסטון ואפיון PTM

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,4-דיתיאוריתריטול</td><td>SIGMA- אולדריץ'</td><td>D8255&nbsp;</td><td>מגיב לתחזוקה ומינוס; קבוצות SH במדינה המצומצמת; מפחית כמותית דיסולפידים.</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>מאגר ג'ל פותר</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS&nbsp;</td><td>ביו-רד&nbsp;</td><td>1610772</td><td>השתמשו במאגר הריצה 10x Tris/glycine/SDS המעורבב מראש כדי להפריד דגימות חלבון על ידי SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>2-פרופנול (איזופרופנול) הוא אלכוהול משני. הוא נבדק כתחליף לדלק לשימוש בתאי דלק שונים. אבקת CuO מומסת ב-2-פרופנול שימשה לסינתזה בסיוע אבלציה בלייזר של קולואידים Cu. השעיה של 2-פרופנול עם Zn (NO3) 2 שימשה לייצור פוטואנודה של נירוסטה מצופה טיטניום דו חמצני (P25-TiO2 / SS) המצופה בשכבה עבה אחידה של P25-TiO2. פוטואנודה זו שימשה לתהליך הפירוק האלקטרוכימי הפוטו-קטליטי (ECPC).</td></tr><tr><td>30% אקרילאמיד/תמיסת BIS&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>2.6% Crosslinker. מגיב טוהר אלקטרופורזה&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחון</td><td>קרלו ארבה ריגנטס</td><td>401392</td><td>חומצה אצטית היא מגיב כימי חשוב עם יישומים תעשייתיים רבים.</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>אצטון&nbsp; הוא ממס, הידוע בזכות הרבגוניות שלו ביישומי מעבדה, ייצור וניקוי שונים.</td></tr><tr><td>83640320</td> <td>VWR אצטוניטיל</td><td></td><td>עבור HPLC&nbsp; &nbsp; אגרוז</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td> בדרגת LC-MS <td>15510-027</td><td>אגרוז&nbsp; הוא a&nbsp; הטרופוליסכריד&nbsp; משמש לעתים קרובות בביולוגיה מולקולרית.</td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>מינימום 99,0%</td></tr> <tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>לביולוגיה מולקולרית, לאלקטרופורזה, &ge; 98%&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>סוניקטור</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>חומר מפחית המשמש להפחתת קשרי דיסולפיד בחלבונים.</td></tr><tr><td>ערכת כתמי כסף Dodeca&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>ערכת כתמי הכסף של Dodeca קלה לשימוש לאיתור רמות נוןגרם של חלבונים בג'לים פוליאקרילאמיד.</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>GE - Healthcare Life Sciences</td><td>171325010L</td><td>גליצרול הוא תרכובת טריול פשוטה, הוא מעורב כדי לסייע ביציקת ג'ל שיפוע, מייצב חלבון ורכיב חיץ אחסון.</td></tr><tr><td>מעכב פוספטאז עצור&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>קוקטייל מעכב פוספטאז Thermo Scientific Halt משמר את מצב הזרחן של חלבונים במהלך ואחרי ליזיס תאים או מיצוי חלבון רקמות&nbsp; קוקטייל חד פעמי (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז עצור&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>קוקטייל מעכב פרוטאז Thermo Scientific Halt (100X) הם תמיסות מלאי מרוכזות מוכנות לשימוש של מעכבי פרוטאז לתוספת לדגימות למניעת פירוק פרוטאוליטי במהלך ליזיס תאים ומיצוי חלבון. קוקטייל חד פעמי (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioReagent, לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge; 99% (NMR), גבישי</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>אשלגן כלורי, KCl, IS&nbsp; משמש בדרך כלל בשגרת מעבדה. השימוש בו כמאגר אחסון לאלקטרודות pH וכפתרון ייחוס למדידות מוליכות מבוסס היטב.</td></tr><tr><td>קו תאים MCF10</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&nbsp;</td><td>קו תאי אפיתל שבודד בשנת 1984 מבלוטת החלב של אישה לבנה בת 36 עם שדיים פיברוציסטיים. קו תאים זה הופקד על ידי קרן הסרטן של מישיגן.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>מגנזיום כלוריד הוא מוצק גבישי חסר צבע.</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>לאלקטרופורזה, כ. 99%</td></tr> <tr><td>מאגר מי מלח פוספט 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 X PBS (מי מלח חוצץ פוספט) is&nbsp; חוצץ&nbsp; תמיסת מלח מאוזנת&nbsp; משמש למגוון יישומים ביולוגיים ותרביות תאים, כגון שטיפת תאים לפני דיסוציאציה, הובלת תאים או רקמות, דילול תאים לספירה והכנת ריאגנטים.</td></tr><tr><td>אשלגן הקסציאנופראט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>מקבל אלקטרונים, המשמש במערכות הכוללות הובלת אלקטרונים,</td></tr> <tr><td>תמיסת SDS 20% (w/v)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>נתרן דודציל סולפט. מגיב טוהר אלקטרופורזה&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט, ריאגנט פלוס 99%</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>21,726-3</td><td>נתרן תיוסולפט, ריאגנט פלוס 99%</td></tr> <tr><td>חומצה גופרתית</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>חומצה גופרתית, ריאגנט, IS&nbsp; חומצה קורוזיבית במיוחד שמגיעה כנוזל צהבהב מעט צמיג. הוא מסיס במים והוא חומצה דיפרוטית. יש לו תכונות מאכלות, מייבשות ומחמצנות חזקות מאוד, כמו גם היותו היגרוסקופי.</td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>חומצה טריכלורואצטית (TCA) היא&nbsp; משמש כמגיב למשקעים של חלבונים1,2 וחומצות גרעין3.&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td>חומצה טריפלואורואצטית</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>טריטון X-100 הוא חומר פעילי שטח פוליאוקסיאתילן לא יוני המשמש לרוב למיצוי והמסת חלבונים.</td></tr><tr><td>טריפסין מלבלב חזיר</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Proteomics Grade, BioReagent, דימתילציה</td></tr><tr><td>UREA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>אוריאה הוא חומר כאוטרופי ומשמש לדנטורציה של חלבונים. זה מפריע לקשרי המימן במבנה המשני, השלישוני והרבעוני של חלבונים. זה יכול גם להפריע לקשרי מימן הקיימים במבנה המשני של ה-DNA</td></tr></tbody></table>

חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2d-tau

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

באיור 1A, אפשר לראות כיצד חלבוני היסטון נודדים בג'ל חד-ממדי. זהו צעד מקדים חשוב להבנת זמן הריצה של הממד הראשון. לאחר שנקבע זמן ההפרדה הנכון, הפעל את הממד השני. המפה הדו-ממדית של פרוטאופורמים היסטונים מציגה דפוס טופוגרפי ייחודי (איור 1B). כל נקודה באיור 1B מייצגת סוג היסטון ספציפי. שימו לב לאזור המדויק של הג'ל שבו ניתן למצוא כל פרוטאופורם היסטון. זיהוי ספקטרומטריית המסה עבור כל פרוטאופורם היסטון מדווח ב-Perri et al.32. לכן, כל נקודה במצב זה קשורה לסוג היסטון ספציפי. נוכחותם של כתמים נוספים, לצד הכתמים הקנוניים, עשויה להעיד על קיומם של שינויים חדשים. ניתן לרכוש תמונות ג'ל באמצעות דנסיטומטריה, ולנתח את התמונה המתקבלת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
אמינות המפה הדו-ממדית של אוניברסיטת תל אביב תלויה בסיבוב הנקודה. אם הריצה בוצעה כהלכה, הכתמים יופיעו כאותות ברורים ולא יהיו פסים אופקיים ואנכיים גלויים. לעומת זאת, זיהומים בדגימה, בתמיסות ובשכבת האגרוז עלולים לגרום לפסים ו/או פסים בג'ל. איכות הג'ל תשפיע על דיגיטציה של התמונה ועל הניתוח הכמותי והאיכותי הבא. יתר על כן, זה עשוי להשפיע על הצלחת ניתוח Western Blot וחקירות טרשת נפוצה. כדי לאמת את מהימנות השיטה, בדקנו את קרום הניטרוצלולוזה של פרוטאופורמים היסטונים שנפתרו עם הנוגדן העיקרי אצטילאט-ליזין (Ac-K2-100) ארנב mAb32 (איור 2). נוגדן משני HRP נגד ארנב שימש לאיתור אותות היסטון. כצפוי, באמצעות מד צפיפות ניתן לכמת את השינוי המוזר שלאחר התרגום על כל וריאנט היסטון הקיים בכתם.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg"> 
איור 1: 1D ו-2D TAUgel. (A) תמונה מייצגת של דפוס טופוגרפי של היסטונים המתקבלת באמצעות 1D TAUgel. (B) תמונה מייצגת של תבנית טופוגרפית של היסטונים שהתקבלה באמצעות TAUgel דו-ממדי. זיהויי נתונים מדווחים על ידי Perri et al. 32. כצפוי, כל נקודה מייצגת פרוטאופורם היסטון ספציפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg"> 
איור 2: כתם מערבי מייצג 2DTAU. בתמונה ניתן לצפות ברמת אצטילציה של ליזין בכל פרוטאופורם היסטון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ריאגנטים</td>
			<td>ריכוז: 15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% אקרילאמיד/ביס</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 מ' טריס pH 8.8</td>
			<td>2.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מי MilliQ</td>
			<td>3.6 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>100 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>50 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תמד</td>
			<td>5 מיקרוליטר</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: פתרון הרכב תמיסת הג'ל.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>צעד</td>
			<td>זמן</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תיקון 50% מתנול / 5% חומצה אצטית</td>
			<td>1 שעות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>שטפו 30% אתנול</td>
			<td>2 x 20 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לשטוף מים נטולי יונים</td>
			<td>1 x 20 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מגיב תיוסולפט רגיש</td>
			<td>1 דק'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לשטוף מים נטולי יונים</td>
			<td>3 x 20 שניות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>כסף כסף חנקתי</td>
			<td>30 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לשטוף מים נטולי יונים</td>
			<td>3 x 1 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מפתח פיתוח</td>
			<td>25-30 דקות הערה: יש לפתח את הג'ל עד שהכתמים נראים (חום בהיר)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פתרון עוצר</td>
			<td>1 x 10 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לשטוף מים נטולי יונים</td>
			<td>2 x 5 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לשטוף מים נטולי יונים</td>
			<td>1 שעות</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: שיטת צביעת כסף.

חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2D-TAU

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

unveiling-histone-proteoforms-using-2d-tau-gel-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר פרוטוקול להערכת מצב הזרחן של חלבון טאו על ידי בדיקת פוספטאז בתאי סרטן המעי הגס. אנזים פוספטאז פועל על קבוצות הפוספט הקיימות על חלבון טאו, ומגביר את הניידות של חלבון טאו בג'ל SDS PAGE בהשוואה לדגימות חלבון טאו שלא טופלו.

בדיקת פוספטאז בתאי CRC: שיטה לבחינת מצב הזרחן של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

סרטון זה מדגים את השימוש בטכניקות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לזהות זרחונים מרובים בחלבון. הזרחן של חלבון בחומצת אמינו ספציפית גורם להסרת ההגנה של מימן אמיד השכן, אשר יוצר את ההבדל הספקטרלי.

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית לזיהוי זרחונים מרובים בחלבונים

מקור: Bennett, S. A., et al.,  אפיון שינויים בשינוי פוסט-תרגומי של היסטון במודלים של חלבונים ניווניים של שמרים. J. Vis. Exp. (2019). סרטון זה מדגים את ההליך של הערכת שינויים בהיסטון בתאי שמרים המבטאים יתר על המידה חלבונים ניווניים. השלבים כוללים ליזיס תאים, צנטריפוגה, אלקטרופורזה, העברת ממברנה וזיהוי מבוסס נוגדנים של היסטונים ששונו.

איתור שינויים בהיסטון בתאי שמרים עם ביטוי יתר של חלבון ניווני

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי זרחונים מרובים של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), תוך שימוש בחלבון טאו כמקרה מבחן. טאו רקומביננטי מועשר איזוטופית ושונה במבחנה על ידי קינאז לפני איסוף הנתונים וניתוחם.

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

כאן, אנו מציגים דו-ממדית בג'ל (2DE) בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS) להפריד ולזהות פרוטאום רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי, אשר מציג תבנית לשחזור וטוב 2DE. חלבונים רבים שנצפו במקום כל 2DE בעת ניתוח סרטן מורכב פרוטאום עם השימוש של MS רגישות גבוהה.

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

פרוטוקול זה מתווה נהלים ניסיוני לאפיון הגנום כולו לשינויים ברמות של היסטון post-translational שינויים (PTM) המתרחשים בהקשר ביטוי של חלבונים הקשורים ALS מחלת פרקינסון ב מודלים האפייה . לאחר ההפרדה מרחביות-דף, רמות PTM היסטון בודדים מזוהים עם נוגדנים ספציפיים שינוי באמצעות סופג המערבי.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.

מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות

למדו איך לאפיין היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזת ג'ל 2D-TAU לזיהוי מטרות תרפויטיות אפיגנטיות חדשות. שיטה זו משפרת את הטיפול בסרטן ומפחיתה עמידות כימותרפית.

חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2D-TAU

גלה סרטונים נוספים