מחקר רב-מודאלי של שיפוץ לב וכלי דם בעכברים: אולטרסאונד ארבע-ממדי והדמיית ספקטרומטריית מסה

המעבדה שלנו משתמשת בהדמיית אולטרסאונד פרה-קלינית כדי לחקור ביומכניקה קרדיווסקולרית במחלות ומצבים פיזיולוגיים שונים. אנו משתמשים גם בהדמיית ספקטרומטריית מסה כדי לחקור את ההתפלגות המרחבית של שומנים ברקמות הלב וכלי הדם והמוח. אנו מנסים לראות היכן ברקמה יש לנו שינויים תפקודיים ומולקולריים.

למרות שטכניקות הדמיה מולקולרית נפוצות, כמו היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, יכולות להניב נתונים מולקולריים, הן מוגבלות על ידי כתמים ונוגדנים הזמינים כיום. מצד שני, הדמיית ספקטרומטריית מסה היא גישה לא ממוקדת למחקרים מולטיומיים שעדיין שומרת על שלמות מרחבית של הרקמה. בעזרת הטכניקה שלנו, אנו יכולים להרחיב את המולטיומיקס כך שיכלול שומנים, גליקנים ופפטידים, ולשלב אותם עם טכניקות הדמיה פונקציונליות, כגון אולטרסאונד.

בעזרת טכניקות אלה, חוקרים יכולים כעת לשלב הדמיה פונקציונלית עם טכניקות הדמיה מולקולרית. במעבדה שלנו, יש לנו שני תחומי מיקוד עיקריים למחלות לב וכלי דם, ואחד מהם הוא בחינת שיפוץ לב עם התקפי לב או טיפולים בסרטן, כלומר רעילות לב. והמטרה הקרדיווסקולרית הגדולה השנייה שלנו היא להסתכל על ההזדקנות וכיצד ההזדקנות משפיעה על כלי הדם.

כדי לבצע אולטרסאונד לב ארבע-ממדי, הנח את העכבר במצב שכיבה על לוחית ההדמיה. לאחר מכן, הנח את המתמר במחזיק במצב נעול למחצה. יישר את הנקודה המוגבהת על המתמר עם הנקודה הכחולה על המסך, ומקם אותה לכיוון הצד הימני של העכבר.

סובב את המתמר כדי ליישר לאורך המישור הסגיטלי של העכבר כשהחריץ המוגבה מצביע בזנב. מרחו כמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד על פני הגחון של חלל בית החזה לצימוד אקוסטי עם מתמר. הורד את המתמר עד שהוא יוצר קשר עם ג'ל האולטרסאונד.

בצע התאמות מדויקות עם כפתורי ה-XY בבסיס הצלחת לכוונון עדין. לאחר מכן, ודא שתצוגת הציר הארוך הפריסטרנלי על המסך כוללת את הקודקוד, דרכי היציאה של החדר השמאלי ואבי העורקים, מיושרים אופקית להדמיה מדויקת. בחר Name Image בפינה התחתונה של המסך כדי לשמור את התמונה בסדרה הנוכחית.

סובב את המתמר 90 מעלות בכיוון השעון כדי לקבל תצוגת ציר קצר פריסטרנלית. ודא שהחדר השמאלי מוגדר בבירור בתמונה ושהשרירים הפפילריים נראים לעין. בחר את סמל הקוביה בפינה השמאלית העליונה של המסך כדי להגדיר תמונה ארבע-ממדית.

לאחר איפוס המתמר, כוונן את מיקום ההתחלה ממש מתחת לקודקוד ואת מיקום העצירה לקשת אבי העורקים. הגדר את גודל הצעד ל-0.08 עד 0.13 מילימטרים ואת קצב הפריימים ל-200 עד 300 הרץ. ודא שסימנים חיוניים ואות ה-EKG נשארים יציבים לפני תחילת הסריקה.

לאחר השלמת הסריקה והעיבוד, הפעל את שמירת נתוני EKV/4D ושער נשימה לעיבוד שלאחר מכן. בחר שם תמונה בפינה השמאלית התחתונה וכלול את מזהה העכבר בשם. כדי להציג באופן חזותי כל מישור ראייה במהלך מחזור הלב, בחר פקדים נוספים ובחר טען לארבעה מימדים.

סקור כל מישור של הלב, ואשר שמרכז הלב נשאר יציב לאורך כל מחזור הלב. כדי להתחיל, הכינו סירות נייר אלומיניום להקפאת בזק של רקמות עכבר. בעזרת מלקחיים, אוהל את עורו של העכבר שהורדם וחתוך את עור האוהל עם מספריים מעל הצוואר לגישה לכלי הדם או ממש מתחת לעצם החזה לגישה לבבית.

המשך לחתוך את שכבות העור והשרירים כדי לחשוף את כלי הדם. להסרת הלב, חתכו את העצם כדי לחשוף את הלב. בעזרת דיסקציה קהה עם צמר גפן, בודד את הלב או כלי הדם מהרקמות שמסביב, כולל שומן.

הפרד בזהירות את כלי הצוואר מהעצב. לאחר מכן, הסר את הלב או כלי הדם באמצעות כלים כירורגיים. הנח את כלי הצוואר, הלב וכלי הדם על סירת נייר אלומיניום מסומנת מראש.

לאחר מכן, הניחו את הסירות בחנקן נוזלי להקפאת בזק. כדי להתחיל, מלאו במי HPLC והניחו אותה בצד יחד עם מזרקים של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, הגדר את טמפרטורת הקריוסטט למינוס 25 מעלות צלזיוס והכנס את הלהב.

הנח זוג מלקחיים בתוך תא הקריוסטט להתקרר לפני הרכבת הטישו. שואבים חמישה מיליליטר של מי HPLC למזרק ומניחים אותם בקריוסטט כדי להקפיא חלקית את המים. לפני שהמים במזרק קופאים לחלוטין, הוציאו אותם על צ'אק המתכת והניחו לו לקפוא לחלוטין.

כעת, מלאו מזרק של מיליליטר במי HPLC והניחו אותו בקריוסטט. לאחר 30 עד 60 שניות, הניחו מעט מים מוצקים חלקית על מרכז הצ'אק. בעזרת מלקחיים, הנח במהירות את לב העכבר שחולץ לתוך טיפת המים והחזק אותו שם עד שהמים שמסביב קפואים לחלוטין.

כדי להתחיל, הסר את השקופית עם לב העכבר המותקן מהמקפיא והניח אותה במייבש לייבוש. הפעל את מרסס HTX M3+. פתח את אפליקציית HTX במחשב הנייד, ובשיטה, הגדר את טמפרטורת הזרבובית ל-75 מעלות צלזיוס, את קצב הזרימה ל-100 מיקרוליטר לדקה ואת הלחץ ל-10 psi.

רשום את שם הדגימה, הקוטביות, המטריצה, הממס והריכוז במחברת המעבדה. לאחר מכן, חשב את כמות המטריצה הנדרשת לריכוז הרצוי. לאחר מכן, שקלו את הכמות הרצויה של 2, 5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית עבור מטריצת המצב החיובי.

ממיסים את המטריצה ב-70% מתנול בצינור של 15 מיליליטר. סוניקציה של תמיסת המטריצה למשך 10 דקות. במהלך סוניקציה, הסר את השקופית מחומר הייבוש.

פתח את מגש המרסס. לאחר מכן, הנח את השקופית בפינה השמאלית התחתונה והדבק את הקצוות. בחר את אזור הריסוס לדוגמה וסגור את המגש.

בעזרת מזרק ומסנן, משוך את תמיסת המטריצה למזרק. מסננים את תמיסת המטריצה דרך המזרק לתוך הבקבוקון כשהמכסה השחור ממוקם בצד שמאל של המרסס. הנח את הבקבוקון בחזרה למקום המיועד לו על המרסס והכנס את צינור קו D היטב לתוך הבקבוקון.

לאחר מכן, הפעל את הגז האינרטי וודא שהמד במרסס קורא 10 psi. לחץ על התחל, וברגע שהמרסס יגיע לטמפרטורה שנקבעה, בחר בלחצן התחל המהבהב כדי להתחיל בריסוס. לאחר השלמת הריסוס, הסר את הדגימה מהמרסס והנח אותה במחזיק השקופיות MALDI.

סרוק את מחזיק השקופיות של MALDI והחלק באמצעות סורק. שמור את התמונה בכונן הבזק לשימוש עם הדמיית ספקטרומטריית מסה. בחר באפשרות הכביסה במרסס והעבר את קו D מבקבוקון המטריצה לכוס הפסולת.

לבסוף, רססו מתנול על מגש המרסס ונגבו אותו. כבה את החנקן. הדמיית ספקטרומטריית מסה של MALDI של רקמת שריר הלב האוטמת זיהתה מסת יונים מולקולרית למטען 577.52, ככל הנראה תואמת ל-COHb ב-C או D, מה שמרמז על מעורבות בשיפוץ שריר הלב.

תמונת האולטרסאונד הארבע-ממדית הראתה אזורי שריר הלב עם פחות מ-20% שטח פנים מתוח, המוצגים כרקמה ירוקה-צהובה, המצביעה על אזורים עם אוטם. במבט על הציר הארוך של רקמת אוטם שריר הלב, ניתן היה לראות דה-לוקליזציה של שומנים, מה שמסבך את המתאם בין ביומכניקה של רקמות להרכב מולקולרי.