המעבדה הצפה: נוהל תפעולי סטנדרטי לאיסוף וסינון דגימות מי ים ממעבורות הפעלה לניתוח DNA סביבתי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדשני לאחזור דנ"א סביבתי ימי באמצעות איסוף וסינון של דגימות מי ים ממעבורות תפעוליות וכלי שיט מסחריים אחרים.

מטרת המחקר שלנו היא סקר על קהילות ביולוגיות בים הפתוח באמצעות כלי שיט מסחריים כפלטפורמה לאיסוף דגימות DNA סביבתיות. במקרה הספציפי שלנו, ההתמקדות היא בצטאיקנים. נסה לזהות אזור ימי, אסטרטגי מבחינה אקולוגית להגנתם. בעוד שרכישת דגימת EDNA היא קלה ביותר, רק איסוף דגימות מי ים, ולמרות שהטכנולוגיה האנליטית מתקדמת כל הזמן, האתגר האמיתי הוא כיצד להגיע לסביבות שיש לנטר, במיוחד כאשר קשה לגשת אליהן, כמו במקרה של מים ימיים של מים עמוקים. בעוד ש-EDNA הופכת לעתים קרובות לטכניקת הבחירה לחקר הסביבה הימית, חסרים פרוטוקולים המאפשרים עיבוד קל וניתן לשחזור של דגימות בנפח גדול בשטח. מכיוון ש-EDNA מתכלה בטווח זמן של שעות, חיוני לסנן ולאחסן דגימות EDNA ממי ים לאחר האיסוף כדי להבטיח שליפה ויעילות מקסימלית. הפרוטוקול המוצג מסתמך באופן מלא על הפעלת סירות מעבורת לאיסוף נתונים. ניטור מבוסס מעבורת מציע מספר יתרונות, כגון יכולת חזרה, הכבישים קבועים ופועלים כל השנה, מאפשרים ניטור עונתי, גישה נוחה למים ימיים, ביצוע איסוף דגימות ללא פליטות, מה שמאפשר דגימה גם בשעות הלילה, ולבסוף הפחתה דרסטית של עלויות הדגימה. באמצעות פרוטוקול זה, אספנו וסיננו מספר רב של דגימות, שהגיעו לאזורים מרוחקים וימיים, מה שאפשר רזולוציה מרחבית מוגברת למחקר שלנו. זה רלוונטי במיוחד כאשר אנו מתמקדים באורגניזמים ימיים שחיים בים פתוח, כלומר יונקים ימיים. האם המידע שהתקבל מה-EDNA שלהם יכול לשפוך אור על תפוצתם, העדפת בית הגידול ובסופו של דבר מצב השימור שלהם.

[קריין] כדי להתחיל, רשום את מהירות השיוט הנוכחית או הממוצעת של המעבורת במסלול כדי להעריך את הארכת קטע הדגימה. לאחר חיטוי משטח הסינון, פתח מעט את ברז איסוף הדגימה למשך השייט. השתמש בזרימה הרציפה של מי הים כדי לשטוף את צינור האיסוף במים מקומיים ולהשליך את עודפי המים בבור. השתמש בטוש קבוע כדי לתייג את ה-BIB עם הפרטים הנדרשים. הסר את סרט התקרה מפתח ה-BIB ומלא אותו בכ-13 ליטר מי ים. כאשר ה-BIB כמעט מלא, הסר את סרט התקרה מהמכסה, והשאיר את הסרט סביב הברז שלם. לאחר איטום ה-BIB בחוזקה, שימו לב לזמן המדויק שבו הושלם איסוף הדגימות, ורשמו את משך הזמן הכולל של איסוף הדגימות. כתוב את זמן ההשלמה על ה-BIB באמצעות טוש קבוע, והעביר את המידע לטופס איסוף וסינון הדגימות. הנח את הסינר המלא בחדר האחסון או באזור הסינון. להכנת תחנת הסינון, חבר את משאבת הוואקום לפיית היניקה של בקבוק הוואקום, והנח את הפקק עם התמיכה על צוואר הבקבוק כדי להכיל את גליל הסינון. הכן את כל החומרים הדרושים, והרכיב את מערכת הסינון בחלל המיועד לסינון. השתמש בצילינדר חדש לכל תחנה, ובזוג חדש של פינצטה חד פעמית או פינצטה מעוקרת. כדי למזער את הסיכון לזיהום, הנח שרוול בידוד כגון שקית ניילון בין הברז לגליל הסינון כדי לבודד את זרימת המים. הפעל את משאבת הוואקום והפעל את הטיימר כדי לתעד את זמן הסינון. העבירו עד ארבעה ליטר מים לכל מסנן, והבטיחו שהגליל יישאר מלא לאורך כל התהליך כדי למנוע כניסת אוויר. כאשר המים המסוננים מגיעים לסימן ארבעה ליטר, כבה את משאבת הוואקום ועצור מיד את הטיימר. רשום את זמן הסינון בגיליון יומן הנתונים. לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי לשחזר בזהירות את המסנן הראשון או מסנן a מהגליל, ולהימנע מכל נזק. קיפל אותו לשניים כשהצד שומר על חומר ביולוגי מקופל פנימה, ועטוף אותו בנייר אלומיניום. סמן את נייר הכסף עם מספר הדוגמה, וסנן מזהה שכפול לפני אחסונו במקפיא. התקן מסנן חדש בתוך גליל הסינון לסבב הסינון הבא, ורוקן את הבקבוק. לאחר סינון. אחסן את כל המסננים בין מינוס ארבע מעלות צלזיוס, למינוס 20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד מעבדה נוסף. רגע לפני הירידה, אחזרו את כל הדגימות והניחו אותן במקררים ניידים בטמפרטורה נמוכה להובלה. איסוף DNA סביבתי ימי, וניתוח באמצעות ציפוי מטא בר, זיהה מינים מרובים של בעלי חוליות כולל דגי אריחים, אבוי, ברינקס ויונקים לאורך המסלול שנדגם, מה שמאפשר שחזור של הרכב קהילת החולייתנים והמבנה הטרופי.