מודל עכבר של טרנספורמציה דימומית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה חריפה בשילוב עם איסכמיה מוקדית חולפת

במחקר הנוכחי, אנו שואפים לספק פרוטוקול מקיף ומפורט לביסוס מודל בעלי חיים הניתן לשחזור של טרנספורמציה רדיקלית אנושית באמצעות רפרפוזיה של חסימת עורק המוח האמצעי בעכברי C57BL/6 עם היפרגליקמיה חריפה.

בהשוואה לטכניקות אחרות, הפרוטוקול שלנו מדגים יכולת חזרה טובה, יציבות גבוהה ותמותה נמוכה של בעלי חיים, מה שהופך אותו למתאים לשימוש נרחב במחקר פרה-קליני של טרנספורמציה דימומית.

בעתיד, ההתמקדות שלנו תהיה בחקירת ההשפעה של טרנספורמציה דימומית על נוירולוגית ולחקור את המנגנון הבסיסי.

[מדריך] כדי להתחיל, נגב את פלטפורמת הניתוח ואת אזור העבודה שמסביב עם 75% אתנול. הפעל את מתג החימום והגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. העבר את העכבר המורדם על משטח הניתוח במצב שכיבה ואבטח את גפיו באמצעות סרט דבק. לאחר מכן, 15 דקות לפני ההליך הכירורגי, יש לתת לעכברים 30% גלוקוז או מי מלח רגילים. בעזרת אזמל מבצעים חתך אופקי עם פתח של 1.5 סנטימטרים לאורך קו האמצע של הצוואר. בצע דיסקציה קהה באזור המשולש ההפוך כדי לזהות ולהפריד את עורק הצוואר המשותף השמאלי. בעזרת מלקחיים עיניים יש לנתח את עצב הנרתיק הסמוך לעורק הצוואר המשותף ואת הרקמה הרירית המקיפה את כלי הדם. עם תפר נספג של 5-0 חומצה פוליגליקולית, צור צלצול על עורק הצוואר המשותף, תוך שמירה על התפר לא מתוח. לאחר מכן, היפרד כלפי מעלה לאורך עורק הצוואר המשותף. כעת, הפרד את ההסתעפות כדי לחשוף באופן מלא את עורק הצוואר החיצוני והפנימי. לולאה וקשר בחוזקה תפר נספג של חומצה פוליגליקולית 5-0 סביב עורק הצוואר החיצוני באופן דיסטלי מההתפצלות. לאחר מכן, באמצעות שני מהדקי עורקי עורקים מיקרו סראפיין קלים, מהדקים באופן זמני גם את עורק הצוואר המשותף וגם את עורק הצוואר הפנימי כדי לחסום את זרימת הדם. לאחר מכן, מתחו את עניבת התפרים על עורק הצוואר החיצוני הדיסטלי ועורק הצוואר המשותף כדי ליישר את קטע עורק הצוואר החיצוני. כעת, השתמש במספריים מיקרו כדי לבצע חתך קטן בין שני קשרי התפרים בעורק הצוואר החיצוני. הכנס תפר מונופילמנט מצופה סיליקון באורך 30 מילימטר לעורק הצוואר החיצוני. לולאה וקשר מעט תפר נספג שני של חומצה פוליגליקולית 5-0 על עורק הצוואר החיצוני ליד ההסתעפות כדי למנוע מתפר המונופילמנט לסגת. לאחר מכן, חתכו לחלוטין את עורק הצוואר החיצוני הדיסטלי לקשירה הקבועה, והסירו את מהדק מלקחיים העורקים מעורק הצוואר הפנימי. לאחר מכן, משוך את התפר להתפצלות עורק הצוואר המשותף. נסוג בזהירות וסובב את גדם עורק הצוואר החיצוני. התאם את כיוון התפר והכנס אותו 9 עד 10 מילימטרים מהתפצלות עורק הצוואר המשותף לעורק הצוואר הפנימי כדי לחסום את עורק המוח האמצעי. לאחר מכן, הדק את התפר השני הנספג בחומצה פוליגליקולית סביב עורק הצוואר החיצוני והסר את מהדק העורק מעורק הצוואר המשותף. לאחר הרדמה מחדש של העכבר, באמצעות מהדק עורק מיקרוקליפ, מהדקים את עורק הצוואר המשותף. החזר חלקית את המונופילמנט מעורק הצוואר הפנימי עד שהקצה המצופה סיליקון נראה דרך עורק הצוואר הפנימי. לאחר מכן, הנח מהדק עורק מיקרוקליפ נוסף על עורק הצוואר הפנימי מעל הקצה המצופה סיליקון. משוך לחלוטין את המונופילמנט וקשר בחוזקה את גדם עורק הצוואר החיצוני. לבסוף, הסר את מהדק עורק המיקרוקליפ מעורק הצוואר הפנימי ומעורק הצוואר המשותף בהתאמה. כדי להתחיל, נגב את זנב העכבר עם צמר גפן ספוג אלכוהול כדי להפוך את וריד הזנב להיפרמי לחלוטין. בעזרת מספריים כירורגיים, חתכו את קצה הזנב במילימטר עד שניים. לחץ בעדינות לאורך שורש הזנב עד הקצה כדי להקל על זרימת הדם החוצה מהחתך. לאחר מכן, מקם את מיכל ספיגת הדגימה של נייר הבדיקה בקצה טיפת הדם. קרא את קריאת מד הסוכר בדם ורשום את התוצאה. למדידת זרימת דם מוחית, החזק את קצה בדיקת הזרימה של דופלר הלייזר בניצב לפני השטח של הגולגולת הקודקודית השמאלית עד לקריאת שטף יציב, ורשום ערך זה. לאחר הסרת המוח של עכבר ה-MCAO שעבר המתת חסד, הניחו את רקמת המוח במטריצת מוח של מכרסמים וחתכו אותה לפרוסות עטרה של שני מילימטרים. מעבירים את הפרוסות לצלחת של 24 בארות ומדגרים אותן בתמיסת 2% 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, מהדקים את חלקי הרקמה מהצלחת בת 24 הבארות בעזרת מלקחיים מעוקלים ומסדרים אותם על צלחת סריקת הזכוכית. צבעו את פרוסת המוח הקבועה בתמיסת המטוקסילין למשך שלוש דקות. הבדיל אותו על ידי טבילת הפרוסה באלכוהול חומצה הידרוכלורית 5% למשך חמש שניות. לאחר מכן, יש לייבש ולהיאלין את הפרוסה באמצעות תמיסות אתנול שיפוע וקסילן. הרכיב את הקטע עם שרפים ניטרליים. 23 שעות לאחר MCAO, יש להזריק 2% תמיסת Evans Blue לעכבר ולקצור את המוח. לאחר הומוגניזציה וצנטריפוגה של הרקמה, העבירו את נוזל העל-טבעי לצינור צנטריפוגה אחר ודללו אותו פי ארבעה באתנול. מדוד את הספיגה של נוזל העל-טבעי ב-620 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. הזרקו FITC-דקסטרן לווריד הזנב 24 שעות לאחר MCAO ואפשרו לו להסתובב בדם למשך 10 דקות. לאחר קיבוע רקמת המוח, הטמיעו את רקמת המוח באמצעות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית וחתכו אותה למקטעים בעובי 30 מיקרומטר. העבירו את החלקים לשקופית מיקרוסקופ באמצעות לולאת חיסון, וודאו שהם נצמדים למשטח השקופית. הרכיבו את חלקי רקמת המוח באמצעות מדיום הרכבה המכיל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. רמות הגלוקוז בדם עלו באופן משמעותי לאחר MCAO בעכברים שהוזרקו להם גלוקוז בהשוואה לקבוצות המלח. לא נצפה אוטם גלוי על פרוסות מוח בדמה עם מי מלח או דמה עם קבוצת גלוקוז. קבוצת MCAO עם גלוקוז הראתה נפח אוטם מוחי גדול משמעותית בהשוואה לקבוצת MCAO עם מי מלח. דימומים מנוקבים מרובים נצפו בהמיספרה האיסכמית של ה-MCAO עם קבוצת הגלוקוז, שנעדרו בקבוצות האחרות. חדירה משמעותית של תאי דם נצפתה באזורי האוטם של קליפת המוח והסטריאטום בקבוצת MCAO עם גלוקוז. חדירות אוונס בלו ודליפה של FITC-dextran היו גבוהות באופן ניכר בקבוצת MCAO עם גלוקוז בהשוואה לקבוצת MCAO עם מי מלח.