הפלת גנים יעילה בכבד באמצעות הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המסופקת על ידי נגיף הקשור לאדנו Serotype 8 (AAV8)
1 בנובמבר 2024
פרוטוקול זה מתאר כיצד הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המועברת על ידי AAV8 משיגה את אותה יעילות הפלת גנים בכבד כמו הזרקת וריד פורטלי, המייצגת הליך פשוט יותר עם תמותה וסיבוכים נמוכים בהרבה סביב הניתוח ואחרי הניתוח.
המחקר שלנו מתמקד בשיפור ההבנה של התקדמות הפרעה מורכבת באמצעות שיטות חישוביות וניסיוניות. אנו מתמקדים בפיתוח אסטרטגיה להאטת או היפוך התקדמותן של מחלות מורכבות כגון הפרעות מטבוליות, הזדקנות וסרטן. שאלת המפתח שאנו מנסים להתייחס אליה כאן היא מדוע נגעים טרום סרטניים מסוימים מתפתחים לסרטן, מדוע רקמה בוגרת מסוימת יכולה להשיג התחדשות לאחר פציעה, ומה מניע את תהליך ההזדקנות. טכנולוגיות אלו כוללות ריצוף גנום שלם, ריצוף תא בודד, אלגוריתם חישובי ולמידת מכונה חזק, מודלים של בינה מלאכותית ומודלים ניסיוניים של בעלי חיים הרלוונטיים למחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה ל-In-Vivo Gene Knockdown באמצעות הזרקות תוך-טחוליות של AAV8, המסופקות במבנה RNA קצר סיכת ראש המכוון לגזע גרעיני. גזע גרעיני הוא גורם חידוש עצמי של תאי גזע הממלא תפקיד חשוב בהתפתחות עוברית, התפתחות סרטן והתחדשות רקמות בוגרות. הראינו כי בהשתלה זריקות של AAV8 מספקות RNA סיכת ראש קצרה משיגות את אותה יעילות נוקדאון. קבוצה של זריקות וריד פורטל של AAV8 מספקות מבנה, אך זה קשור להרבה פחות סיבוכים וההליך הרבה יותר פשוט.
[מדריך] כדי להתחיל, העבירו את העכברים המורדמים לאזור הניתוח האספטי בתנוחת שכיבה רוחבית ימנית. בעזרת להב כירורגי, בצע חתך של 15 מילימטר בדופן הבטן העליונה השמאלית, ולאחר מכן חתך של 10 מילימטר על הצפק. בעזרת מלקחיים חשפו בעדינות את הטחול והניחו חתיכת גזה רטובה מתחתיו כדי להחזיק אותו במקומו. לאחר מכן, באמצעות מחט בקוטר 30, הזריקו 50 מיקרוליטר של נגיפי AAV8 לטחול בעומק של שלושה מילימטרים מתחת לפני השטח במשך תקופה של 30 שניות. לאחר מכן מכסים את האתר בצמר גפן ודוחסים אותו למשך דקה. לאחר מכן, תפר את דופן הבטן באמצעות תפר נספג 4-0. לאחר מכן סגור את העור באמצעות תפר 4-0 שאינו נספג. לאחר ההרדמה, העכברים מבצעים לפרוטומיה על ידי ביצוע חתך בקו האמצע בעור ולאחר מכן לתוך הצפק. הניחו כרית גזה סטרילית ספוגה במי מלח סטריליים בצד שמאל של העכבר. בעזרת צמר גפן סטרילי שולפים בעדינות את המעי הגס והדק. הניחו את המעיים על גבי פד גזה רטוב וכסו אותם כדי למנוע ייבוש או מגע עם העור. לאחר מכן באמצעות מחט סטרילית בגודל 32, הזרקו 50 מיקרוליטר של נגיף AAV8 לווריד הפורטל בזווית של פחות מחמש מעלות. הכנס את המחט שלושה עד חמישה מילימטרים לווריד הפורטלי ואפשר לדם לזרום מעבר למחט למשך חמש שניות כדי למנוע זרימה חוזרת. לאחר מכן, הניחו צמר גפן סטרילי על מקום ההזרקה והפעילו לחץ עדין עד לסגירה מלאה של הווריד ולא מתרחש דימום. לאחר מכן, החזר בעדינות את האיברים הפנימיים בחזרה לחלל הבטן. לאחר מכן, סגרו את דופן הבטן באמצעות תפר נספג 4-0 ואת העור עם תפר 4-0 שאינו נספג. הזרקות תוך טחול ווריד פורטלי הראו יעילות שווה ערך סטטיסטית של ה-mRNA ללא הבדלים משמעותיים בין שתי השיטות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה להשתקת גנים in-vivo באמצעות הזרקות תוך-טחוליות של RNA בעל סיכה קצרה (shRNA) המועבר על ידי AAV8. גישה זו משיגה יעילות השתקת גנים בכבד דומה לזו של הזרקה לווריד השער, בעוד שהיא פשוטה יותר וכרוכה בפחות סיבוכים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- תרפיה גנטית
- מדעי המוח
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- הבנה של טכניקות להשתקת גנים היא קריטית למחקר של מחלות מורכבות.
- AAV8 הוא וקטור ויראלי המשמש להעברת חומר גנטי.
- גורמי stemming גרעיניים חשובים בתהליכים ביולוגיים שונים.
- מזעור סיבוכים כירורגיים הוא חיוני לשיפור תוצאות הניסוי.
מטרת המחקר
- להשוות את היעילות של הזרקות תוך-טחוליות לעומת הזרקות לווריד הפורטלי עבור השתקת גנים.
- לפשט את הפרוצדורה תוך שמירה על היעילות.
- להפחית סיבוכים פרי-אופרטיביים ופוסט-אופרטיביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה תוך-טחולית של RNA בעל סיכה קצרה (short hairpin RNA) המועבר באמצעות AAV8.
- הזרקה לווריד הפורטלי של AAV8 כשיטה להשוואה.
- שימוש בעכברים מורדמים להליכים כירורגיים.
- ניתוח סטטיסטי להשוואת יעילות השתקת הגנים.
תוצאות עיקריות
- שתי שיטות ההזרקה השיגו יעילות knockdown גנית שקולה מבחינה סטטיסטית.
- הזרקה תוך-טחונית (Intrasplenic injection) הייתה קשורה לפחות סיבוכים.
- הפרוצדורה הייתה פשוטה יותר בהשוואה להזרקה לווריד הפורטלי.
- התוצאות תומכות בשימוש בהזרקה תוך-טחונית כחלופה רלוונטית.
מסקנות
- הזרקה תוך-טחונית (Intrasplenic) של AAV8 היא שיטה יעילה להשקת גנים (gene knockdown).
- שיטה זו יכולה לקדם מחקרים בתחומי הטיפול הגנטי والرפואה הרגנרטיבית.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון את ההשפעות ארוכות הטווח של טכניקה זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
השחלה יעילה ומינימלית פולשנית של השתקת גנים בכבד היא קריטית לאישור יעדים ולהסרת סיכונים מכניסטיים במחקרי מטבוליזם, רגנרציה ואונקולוגיה. פרוטוקול הזרקה לסבכה (intrasplenic) של AAV8-shRNA מאפשר השתקת גנים חזקה תוך הפחתת הסיכון הפרוצדורלי, ובכך תומך בגנומיקה פונקציונלית בעלת רמת ביטחון גבוהה במודלים הרלוונטיים למחלה. גישה זו מייעלת את שלבי הגילוי המוקדמים ואת זרימות העבודה הפרה-קליניות על ידי מזעור חסמים טכניים וסיבוכים פרי-אופרטיביים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה פונקציונלית של מטרות גניות בפתופיזיולוגיה של הכבד באמצעות מודלים in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת השתקה גנטית אמינה עם השפעות מינימליות מחוץ למטרה.
- מקל על בדיקה מהירה של השערות לגבי תפקוד גנים במסלולים מטבוליים ורגנרטיביים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מתוקף ליצירת מודלים של השתקת גנים (gene knockdown) המתאימים לסריקת תרכובות בשלבים הבאים.
- מבטיח הפחתה שחזירה וכמותית של ביטוי גנים, התומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מפחית שונות פרוצדורלית, ובכך משפר את יכולת ההרחבה (scalability) ואת יכולת השימוש החוזר בפלטפורמה עבור יעדים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות in vivo הרלוונטיות למחלה לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור מודולציה עקבית של גנים.
- תומך בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים על ידי מזעור משתנים מתערבים טכניים וביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול AAV8-shRNA תוך-ספלני זה משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ובכך מאפשר תיקוף יעיל של מטרות ויצירת מודלים לצורך זיהוי מובילים ומחקרים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאיצה את בדיקת ההשערות והבהרת המסלולים על ידי אפשרות להשקת גנים מהירה in vivo.
- סריקה: מספקת השתקה הדירה של גנים, התומכת במוכנות של הבדיקה וביצירת פלט כמותי.
- אנליטיקה: מספקת מדידות חסונות סטטיסטית של הפחתת ביטוי גנים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מבטיחה מודולציה של גנים הרלוונטיים למחלה במודלים פרה-קליניים, התומכת בהתאמה של סמני ביולוגים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול סטנדרטי עם סיבוכיות נמוכה, הניתן להתאמה עבור מטרות גנים ומודלים של מחלות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליך תיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות, הסטנדרטיזציה והבטיחות הפרוצדורלית בתהליכי השתקה גנטית.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הפחתת שיעורי הכשלים הטכניים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות מאושרות למסלולי פיתוח פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים בבעלי חיים קטנים וטיפול בווקטורים ויראליים.
- נדרשת גישה לפלטפורמות של ייצור AAV8 וניתוח כמותי של ביטוי גנים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית לביצוע הפרוטוקול ולפירוש הנתונים.
- ניתן להתאימה למטרות גניות שונות, אך עשויה להידרש אופטימיזציה עבור מודלים שונים של מחלות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות אימונוגניות של הווקטור ואילוצים פרוצדורליים הספציפיים למודל.
