Name: רתימת כוחם של מטעני מיקרו-רנא בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות מחלקי מוח אנושיים קפואים טריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: חקור שיטה לבידוד וסיווג שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מרקמת מוח אנושית קפואה טרייה לזיהוי ביומרקרים של מיקרו-רנ"א. הפרוטוקול מאפשר גילוי מוקדם של הפרעות נוירולוגיות כגון דמנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד יעיל של רכיבי sEV במוח מרקמה מינימלית לגילוי סמנים ביולוגיים

<ol><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+Alzheimer%27s+disease+within+the+brain%27s+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome.</a> J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+small+extracellular+vesicles+in+cancer+invasion+and+metastasis%3A+molecular+mechanisms%2C+and+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance.</a> Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).</li>
<li>Constantinides, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+A%CE%B242+and+A%CE%B242%2F+A%CE%B240+ratio+in+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Diagnostics. 13 (4), 783(2023).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+serum+miRNA+biomarkers+associated+with+Alzheimer%27s+disease+shows+concordance+with+neuropsychological+and+neuroimaging+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment.</a> Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).</li>
<li>Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs+as+diagnostic+biomarkers+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease.</a> Front Neurosci. 12, 625(2018).</li>
<li>Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion-like+transmission+of+tau+oligomers+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes.</a> Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).</li>
<li>Vella, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+neuronal+markers%3A+Immunoaffinity+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization.</a> Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).</li>
<li>Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+approaches+for+the+isolation+and+detection+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22TRAC-Trend+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes.</a> TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).</li>
<li>Ransom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+small+extracellular+vesicles+contain+selectively+packaged%2C+full-length+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA.</a> Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).</li>
<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+spontaneously+released+extracellular+vesicles+from+brain+tissue+and+its+implication+for+stress-driven+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).</li>
<li>Welsh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28MISEV+2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Pirisinu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+journey+of+extracellular+vesicles+towards+global+scientific+acclamation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation.</a> Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).</li>
<li>Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+and+chemical-based+methods+to+inactivate+endogenous+blood+ribonucleases+for+nucleic+acid+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics.</a> J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Merck</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>מסכת תאים כתם קרום פלזמה כתום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז Type-III</td><td>StemCell Technologies</td><td>07422</td><td></td></tr><tr><td>ExoSpin עמודים</td><td>ומערכות הנחיית תאי חיץ בע"מ</td><td>EX01-50</td><td>ערכה זו מכילה עמודות SEC המשמשות בניסוי זה, מאגר משקעים ו-PBS נטול EV.</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז עצור (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Lexogen ערכת הכנה לספריית RNA-Seq קטנה</td><td>Lexogen</td><td>052.24</td><td>ערכה זו מכילה קופסת ריאגנטים להכנת RNA קטנה עם לוחית פריימר i7 Index.&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>ערכה זו מכילה ריאגנט ליזה לשחזור RNA באיכות גבוהה (Qiazol), עמודות בידוד RNA, חוצצי בידוד (RWT, RPE) ומים נטולי RNase.</td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים של MiSeq v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td>זוהי ערכת ההכנה של Illumina</td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה, 0.45 &mu; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 אנטי-אנושי CD63 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>143914</td><td>משמש לניתוח fNTA</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 אנטי-אנושי CD81 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>349520</td><td>משמש לניתוח fNTA</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 אנטי-אנושי CD9 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>312118</td><td>משמש לניתוח fNTA</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון 4906845001 פירס BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת מיקרו-RNA של קיוביט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 1X dsDNA ערכת בדיקה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 3.0 פלואורומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה ומיצוי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto מצע רגישות מקסימלית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr></tbody></table>

רתימת כוחם של מטעני מיקרו-רנ"א בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות מחלקי מוח אנושיים קפואים טריים 

Harnessing the Power of MicroRNA Cargoes in Small Extracellular Vesicles Released from Fresh-Frozen Human Brain Sections

כדי לאשר את נוכחותם של BDsEVs, נעשה שימוש בשלוש טכניקות: כתמים מערביים, NTA ו-TEM (איור 3). תוצאות הכתם המערבי (איור 3A וקובץ משלים 1) מראות את נוכחותם של כל חמשת הסמנים החיוביים (CD9, CD63, CD81, Flot-1 ו-TSG101) והיעדר קלנקסין ב-sEVs (המשמש כבקרה שלילית), מה שמאשר שאין זיהום בתוכן הסלולרי. כצפוי, ההומוגנטים של המוח (BH) מראים יותר חלבון ממה שנצפה ב-sEVs עבור הסמנים שנבדקו. תמונות TEM אישרו את המורפולוגיה של BDsEVs ואת גודלם היחסי בתוך הדגימה (איור 3B), מה שאושר עוד יותר על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (איור 3C).
איור 3C (פאנל עליון) מציג את גדלי החלקיקים המבודדים הנופלים בין 50-200 ננומטר. מנתוני NTA, שלוקחים את תוצאת הפיזור כ-100% מהחלקיקים המיוצגים, CMO מייצג כ-52.35% מהחלקיקים (איור 3C, פאנל תחתון) שיש להם שכבת שומנים. מבין החלקיקים המוכתמים ב-CMO, 34.66% הכילו CD9, 15.49% הכילו CD63 ו-12.01% הכילו CD81. עיין בקובץ משלים 2 לנתוני בקרת NTA.
נתוני כימות של RNA מבודד (טבלה 2) מראים רמות הנעות בין 3.24-8.76 (ng/μL), ערכים שנורמלו בעת יצירת ספריות ה-cDNA. תוצאות הבדיקה של TapeStation (איור 4) מראות שיאים עיקריים של כ-120-160 נקודות בסיס, עם שיאים קטנים יותר מתחת לזה של כ-50 נקודות בסיס ושיאים קטנים יותר הגבוהים בסביבות 484 נקודות בסיס.
בדיקות איכות עבור נתוני ריצוף הדור הבא מציגות קריאות באיכות גבוהה ביותר לאחר חיתוך המתאם (איור 5A). כל מיקומי הרצף מציגים ציון Phred של &gt;30, המציין שיעורי שגיאה של פחות מ-1 ל-1000 נוקלאוטידים. איור 5B מראה שהרצפים הרבים ביותר הם בסביבות 21-22 bp, התואמים את טווח הגודל הצפוי עבור מיקרו-רנ"א. באמצעות מיפוי נוסף במורד הזרם (באמצעות BowTie2), באמצעות הכלי הביולוגי לניתוח דגל הדגל של Samtools, מתוך 1,304,100 רצפים מיושרים, 1,116,264 (85%) מופו לאזורי המיקרו-רנ"א בגנום האנושי (build hg38; טבלה 3).
מתוך סך כל ה-miRNAs, 808 miRNAs באו לידי ביטוי בכל 3 הדגימות, כאשר 344 miRNAs חולקו בין כל שלוש הדגימות (~43%), 5 חולקו בין בקרה 1 לבקרה 2, 183 חולקו בין בקרה 1 לבקרה 3, ו-16 חולקו בין בקרה 2 לבקרה 3 (איור 6). מנתונים אלה, ה-miRNA המבוטא הגבוה ביותר בכל שלושת ה-BDsEVs הם has-let-7b-5p, has-miR-143-3p, has-miR-30a-5p, has-miR-221-3p ו-has-let7i-5p. באותה מידה, חמשת ה-miRNA הכי פחות דיפרנציאלי בדגימות BDsEVs (קורא &gt;10) הם has-miR-128-2-5p, has-miR-182-5p, has-miR-193b-5p, has-miR-448 ו-has-miR-505-3p. כל ספירת הקריאה הגולמית והנורמלית ניתנת בקובץ משלים 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig01.jpg"> 
איור 1: זרימת עבודה של עיבוד רקמות. האיור מציג את התהליך ההדרגתי לבידוד של sEVs שמקורם במוח (BDsEVs) מחלקי מוח קפואים טריים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig02.jpg"> 
איור 2: זרימת עבודה של בידוד RNA מ-BDsEVs. האיור מציג את התהליך ההדרגתי של בידוד ה-RNA הכולל מה-BDsEVs, כולל שלב הטיפול המקדים של הסרת כל RNA חוץ-תאי באמצעות פרוטאינאז K ו-RNase A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig03.jpg"> 
איור 3: זרימת עבודה של אפיון BDsEV. האיור מציג שיטות שונות לאפיון ה-BDsEVs. (A) כתם מערבי לזיהוי סמני חלבון ספציפיים ל-sEV. BH מוח הומוגני. Calnexin הוא בקרה שלילית עבור sEVs - היעדר ב-sEV ונוכחות ב-BH מאשרים את טוהר דגימת ה-sEV. עבור סמנים אחרים, כצפוי, כמות החלבון גבוהה יותר ב-BH מאשר בדגימות sEV (20 מיקרוגרם חלבון טעון לבאר). (B) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור מייצג (TEM) עבור BDsEVs בקנה מידה של 200 מיקרומטר, המאשרת את המורפולוגיה הצפויה עם ממברנה דו-שכבתית של שומנים. (C) תרשים התפלגות גודל לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) עבור כל החלקיקים (פאנל עליון). כל נקודת נתונים מייצגת את השונות על פני שלושה שכפולים. פרופורציות מנורמלות עבור חלקיקים ביולוגיים (sEVs) ופרופורציות יחסיות עבור סמני משטח ספציפיים (פאנל תחתון) (הנתונים מוצגים כממוצע ±-SEM של בארות משולשות (n = 3)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig04.jpg"> 
איור 4: בדיקת איכות עבור הכנת ספריית cDNA. ניתוח תחנת טייפ לדגימות בודדות לאחר הכנת ספריית cDNA הפסגות המוצגות בכל גרף מציגות את הגודל של כל תכשיר (ציר אופקי, ב-bp) ואת העוצמה המתאימה של כל שיא (ציר אנכי, FU). ספריית ה-RNA הקטנה הצפויה מגיעה לשיא בסביבות 120-160 bp, כפי שניתן לראות באיור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig05.jpg"> 
איור 5: בדיקת איכות עבור ריצוף miRnome. (A) תרשים FASTQC לאיכות קריאה עבור הדגימות הבודדות לאחר חיתוך המתאם. הציר האופקי מיועד למיקום נוקלאוטידים, והציר האנכי מיועד לציוני פרד. תרשימי קופסאות עבור כל עמדה מציגים את התפלגות ציון פרד על פני כל הקריאות עבור כל עמדה. כל ההתפלגויות בתוך האזור הירוק מאשרות נתונים באיכות גבוהה מאוד (&gt;Q30) המרמזים על הכנת דגימות באיכות גבוהה. (B) התפלגות אורך הרצף עבור כל דגימה מראה שעבור כל שלוש הדגימות, רוב הקריאות היו סביב 21-22 נוקלאוטידים - טווח הגודל הצפוי עבור מיקרו-רנ"א. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig06.jpg"> 
איור 6: חפיפה של ביטוי MicroRNA על פני כל הדגימות. מספר ה-miRNAs שזוהו מכל דגימה (ספירת קריאה ≥-10) ומיקרו-רנ"א ספציפיים המשותפים ביותר מדגימה אחת מוצגים בדיאגרמת ון. כל הקריאות הגולמיות והמנורמלות מוצגות בקובץ משלים 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>נוגדן אפיטופ</td>
			<td>גורם דילול של נוגדן </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכבר נגד CD9</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכבר נגד CD63</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכבר נגד CD81</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכבר נגד משט 1</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכבר Anti-TSG101</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכבר נגד קלנקסין</td>
			<td>1:10 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נוגדן משני נגד עכבר</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: אפיטופים של נוגדנים המשמשים לאפיון BDsEVs וגורמי הדילול שלהם. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>לדוגמה</td>
			<td>ריכוז miRNA (ng/μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>8.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: נתוני כימות של RNA מבודד.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>לדוגמה</td>
			<td>רצפים מיושרים</td>
			<td>miRNA ממופה</td>
			<td>אחוז (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>דוגמת בקרה 1</td>
			<td>1 444 665</td>
			<td>1 133 437</td>
			<td>78.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>דוגמת בקרה 2</td>
			<td>442 808</td>
			<td>381 631</td>
			<td>86.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>דוגמת בקרה 3</td>
			<td>2 024 828</td>
			<td>1 983 726</td>
			<td>97.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ממוצע</td>
			<td>1 304 100.33</td>
			<td>1 166 264.67</td>
			<td>89.43</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 3: כמות רצפי miRNA מיושרים וממופים בהצלחה. 
קובץ משלים 1: נתוני ניתוח כתמים מערביים משלימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: נתוני בקרה משלימים של נת"ע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: ספירת קריאה גולמית ומנורמלת של ניתוח ביטוי miRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%203.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: נתוני ריכוז חלבון משלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%204.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

Small extracellular vesicles (sEVs) are crucial mediators of cell-cell communication, transporting diverse cargoes like proteins, lipids, and nucleic ...

harnessing-power-microrna-cargoes-small-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך...

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs ממלאים תפקידים מכריעים במוח ומהווים מטרות פוטנציאליות למידול ניוון עצבי. עם זאת, הפרעה ברמות ה-miRNA היא מאתגרת בשל האורך הקצר של ה-miRNA וחוסר הנגישות של רקמת המוח. סרטון זה מציג שיטה לעיצוב אנטגומיר והעברה ספציפית למוח באמצעות נוירופפטיד בעכברים.

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת עירוי מיקרו-כירורגית של עכבר, המעבירה ביעילות חומרים ישירות למוח דרך עורק הצוואר הפנימי.

טכניקה אינפוזיה Microsurgery עכבר למשלוח ואלכוהול ממוקד לתוך מערכת העצבים המרכזית דרך עורק התרדמה הפנימי

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה על כיצד לשלב מלאכותי בתיווך microRNA RNA הפרעה optogenetics לעורר במיוחד presynaptic עם העיתון ons עם ביטוי מופחתת של gene (s) סלקטיבי בתוך מעגלים עצביים ללא פגע.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

חקור שיטה לבידוד וסיווג שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מרקמת מוח אנושית קפואה טרייה לזיהוי ביומרקרים של מיקרו-רנ"א. הפרוטוקול מאפשר גילוי מוקדם של הפרעות נוירולוגיות כגון דמנציה.

רתימת כוחם של מטעני מיקרו-רנ"א בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות מחלקי מוח אנושיים קפואים טריים

גלה סרטונים נוספים