Name: הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למד הדמיה חיה של תאי גזע נקבתיים ב-Drosophila melanogaster באמצעות שילוב GFP לחלבון Par-1. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר חלוקת תאים ודינמיקת ספקטרוזום במחזור התא המלא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-Acaimo González Reyes ול-María Olmedo López על ההערות המועילות על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" מ-Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" מ-VI ו-VII PPIT-אוניברסיטת סביליה (P. R-R) ו-"Contrato de Acceso de I+D+i" מ-VI PPIT-אוניברסיטת סביליה (P. R-R). אנו מביעים את תודתנו לחברת ביולוגים בע"מ על מתן זכויות לשיתוף תמונות שעובדו מהפרסום המקורי (doi:10.1242/DEV.199716).

הערה: יש לבצע את שלב 1.4 לפחות יומיים מראש. ניתן לבצע את שלבים 2.1 ו-2.2 יום אחד מראש.
1. הגדרה טרום ניסויית I
<ol>
	<li>הכינו 100 מיקרוליטר של תערובת אנטיביוטיקה סטרפטומיצין/פניצילין (10,000 U/mL פניצילין ו-10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין) ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו 15 מ"ל מהתמיסות הבאות באמצעות מים טהורים שעברו חיטוי, אחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם תוך חודש: נתרן ביקרבונט (NaHCO3) 0.1 M pH 8.0 ו-0.1% Tween 20.</li>
	<li>הכן את מדיום התרבות והתמיסה הבאים במכסה זרימה למינרי כדי למנוע זיהום. השתמש בקצות ובצינורות סינון מעוקרים.
	<ol>
		<li>הכינו 2 מ"ל של סרום בקר עוברי לא מדולל (FBS) ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש בתנאים אספטיים.</li>
		<li>הכינו את מדיום הדרוזופילה של שניידר בתוספת תערובת אנטיביוטיקה של 15% FBS ו-0.6% סטרפטומיצין/פניצילין. הכן 7 מ"ל מנות ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אליקוט אחד מספיק לשני לוחות MatTek (ראה סעיף 2).
		<ol>
			<li>הכן את תמיסת רינגר (128 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl2, 4 מ"מ MgCl2, 35.5 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ Hepes במים טהורים אוטוקלאב; pH 6.9). מכינים 1 מ"ל מנות ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אספו זבובים בני 1-2 ימים המבטאים באופן מכונן ובכל מקום את חלבון ה-Par-1 המותך ל-GFP (קו פולי יוביקוויטין-mGFP6::p ar-1) לתוך שפופרת חדשה עם מזון זבובים בתוספת אבקת שמרים. תרבית אותם במשך יומיים בחום של 25 מעלות צלזיוס בחממה לפני הניתוח.< />
	הערה: ניתן לבצע שלב זה עם כל מדווח בעל תיוג פלואורסצנטי שמעוניין בו.</li>
</ol>
2. ציפוי והכנה של צלחת תחתונה מזכוכית
<ol>
	<li>הנח טיפה של 3 מיקרוליטר של דבק Cell-Tak ספציפי (המכונה מעתה דבק תאים ורקמות) במרכז הכיסוי של צלחת מצופה פולי-D-ליזין בגודל 35 מ"מ (צלחת תחתית זכוכית, ראה טבלת חומרים) ללא פיזור ידני. השתמש בטיפים סטריליים. 
	הערה: יש לאחסן את דבק התאים והרקמות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. במקרה של ניסויים עם שני מצבים גנטיים (בדרך כלל, תנאי בקרה ומוטנטיים), הניחו שתי טיפות בודדות ומופרדות היטב של הדבק באותה צלחת תחתונה מזכוכית. זה יבטיח ששני הרקע הגנטי יצולמו באותם תנאים.</li>
	<li>מיד לאחר מכן, הוסף נפח שווה (3 μL במערך פרוטוקול זה) של 0.1 M NaHCO3 pH 8.0 בזהירות לתוך טיפת הדבק של 3 μL כפי שהומלץ על ידי היצרן וערבב על ידי פיפטינג.</li>
	<li>לאידוי מלא, דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות ולאחר מכן שמרו על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לשימוש למחרת. לחלופין, דגרו את הצלחת המוכנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות עד לאידוי מלא והמשיכו ישירות לשלב הבא. בשני המקרים, שמור על הצלחת עם הכיסוי שלה. השתמש בטיפים סטריליים.</li>
	<li>אפשר לכלי תחתית הזכוכית המוכנה להגיע ל-RT על ידי הנחתו על הספסל למשך 15-20 דקות לפני השימוש.</li>
	<li>שוטפים בזהירות 3 פעמים מהצלחת המוכנה. הימנע מלגעת ולהפריע לשכבות הדבק. בכל שטיפה, הוסף 6 מיקרוליטר מים טהורים שעברו חיטוי ולאחר מכן הסר את המים באמצעות קצה נקי לכל אחת משלוש השטיפות כדי למנוע שאריות של תמיסת NaHCO3.</li>
	<li>אפשר אידוי מלא של המים על ידי הנחת הצלחת הנקייה והמוכנה ב-RT תוך ניתוח למשך 5-10 דקות עם המכסה שלה כדי למנוע חלקיקי אבק.</li>
</ol>
3. דיסקציה של שחלות דרוזופילה ובידוד והרכבה של שחלות
הערה: דיסקציה של השחלות מתבצעת בתמיסת רינגר (במקום המדיום של שניידר) ללא FBS כדי למנוע נוכחות של חלבונים שעלולים להפריע להדבקה של רקמת הדגימה לדבק.
<ol>
	<li>נקו צלחת חיתוך עם שלוש בארות, מלקחיים ומחטי חיתוך עם 70% אתנול לפני שמתחילים.</li>
	<li>הוסף נפח מספיק (~200 מיקרוליטר) של תמיסת רינגר בכל אחת משלוש הבארות.</li>
	<li>נתח את השחלות של 5 נקבות הניזונות משמרים ב-200 מיקרוליטר של תמיסת רינגר בבאר הראשונה בעזרת שני זוגות מלקחיים לפי נהלים סטנדרטיים10,11. תפוס את נקבת הדרוזופילה בצומת בית החזה והבטן עם אחד המלקחיים. לאחר מכן, קרעו בעדינות את הציפורן בבטן האחורית ומשכו את ציפורן הבטן עד ששתי השחלות ייחשפו.</li>
	<li>העבירו את השחלות המנותחות לבאר השנייה כדי להפחית את הזיהום בשאריות של רקמות אחרות או פסולת הנובעת מדיסקציה.</li>
	<li>הסר את מעטפת השריר של 15-20 שחלות בעזרת סטריאומיקרוסקופ (זום 8X-13.5X) עם תאורת דיודה פולטת אור (LED) ומלקחיים עדינים נקודתיים. השתמש בזוג אחד של מלקחיים כדי לעגן את כל גוף השחלה, והשתמש בשני כדי לתפוס בצורה חלקה תא ביצית בשלב מאוחר ולמתוח בעדינות עד שהשריר נשבר ומפגר מאחור. 
	הערה: חיוני להימנע מנזק לגרמריה רק על ידי הפחתת המגע עם חלק זה של השחלות. הסר תאי ביצים ישנים יותר משלבים 8-9.</li>
	<li>העבירו בזה אחר זה את 15-20 השחלות נטולות מעטפת השרירים באמצעות המלקחיים לבאר השלישית המכילה 200 מיקרוליטר של מדיום רינגר.</li>
	<li>הרטיבו מראש קצה של 20-200 מיקרוליטר עם 0.1% טווין 20 על ידי פיפטינג. זה מונע את הידבקות השחלות לדפנות הפלסטיק של הקצה.</li>
	<li>העבירו 6 מיקרוליטר של תמיסת רינגר המכילה את השחלות נטולות מעטפת השריר באמצעות קצה רטוב מראש לצלחת ההדבקה המוכנה (נשמרת ב-RT). 
	הערה: הימנע מכל מגע בין הקצה לשכבת הדבק כדי למנוע ניתוק גרמריה לאחר שקיעת השחלות (השלב הבא). כ-30% מהגרמריה אינם נדבקים כמצופה.</li>
	<li>כדי להבטיח שהשחלות המועברות נדבקות למשטח הדבק, לחץ אותן בזהירות כלפי מטה לתחתית טיפת הצלצול עד שהן באות במגע עם משטח הדבק באמצעות מחט חיתוך או מלקחיים. 
	הערה: אל תנסה לסדר מחדש את השחלות לאחר שהן מתייצבות.</li>
	<li>מלאו את צלחת ה-MatTek בזהירות ב-3 מ"ל של המדיום של שניידר בתוספת תערובת אנטיביוטיקה של 15% FBS ו-0.6% סטרפטומיצין/פניצילין (שלב 1.3). כדי למנוע ניתוק של השחלות, הוסף לאט 1 מ"ל בכל פעם סביב הקצה החיצוני של הצלחת.</li>
	<li>העבר את הצלחת המכילה את השחלות ללא מעטפת השריר על משטח ישר לתחנת המיקרוסקופ.</li>
</ol>
4. הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
<ol>
	<li>הנח את הצלחת על אובייקט 63x של מיקרוסקופ דיסק מסתובב או מיקרוסקופ קונפוקלי (ניתן להשתמש בציוד דומה) ומקד את הדגימה. בחר את מישור ה-z האמצעי עבור כל נגרמריום.</li>
	<li>הגדר את הפרמטרים הניסיוניים הבאים: סוג לכידה: זמן-lapse תלת מימדי, התאם את עוצמת הלייזר של 70/100, אורך גל עירור: 488 ננומטר, טווח ערימת z: 30 מיקרומטר ומרחק בין ערימות Z: 1.2 מיקרומטר, משך: 17 שעות, מרווח בין נקודות זמן: כל 10 דקות.</li>
	<li>אם זמין, באמצעות אפשרות ריבוי מיקומים, הגדר מחדש את קואורדינטות ה-XY של הדגימות ובחר מישור Z באמצע כל גרמריום, מכיוון שערימות ה-z יהיו מרוכזות במיקום זה. התחל את הרכישה. 
	הערה: מכיוון שהרוחב הרגיל של גרמריום הוא 30 מיקרומטר, כל מחסנית Z תהיה ~25-27 חלקים. בהתאם לקונפוקל, ניתן לדמות לפחות 25 גרמריה במרווחים של 10 דקות. בדרך כלל, נעשה שימוש במטרות טבילה בשמן 40x/1.30 NA או 63x/1.40 NA, מתוקנות planapo.</li>
	<li>נתח את התמונות בזמן ובציר Z כדי להמחיש שינויים ספציפיים במורפולוגיה של הספקטרוזום באמצעות תוכנת Imaris או ImageJ (Fiji) 12,13. זמנים ספציפיים בתצפית שלהם מוצגים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1B). כדי להרכיב את הסרטים, בחר ידנית את מישור ה-Z הטוב ביותר בכל נקודת זמן.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).</li>
<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול לניטור נישת ה- GSC של Drosophila melanogaster למשך תקופה ממושכת, עד 16 שעות. רוב הפרוטוקולים לצילום תהליכים ביולוגיים של דרוזופילה מתמקדים בחלונות זמן קצרים יותר וניתן למצוא דוגמאות רבות לדיסקי כנף דמיוניים 15,16,17, בלוטות המין של העובר 18,19 או שחלות 20,21,22,23. אין ספק שמשך רכישת התמונה תלוי בתהליך ההתפתחותי הנבדק. בעוד שאירועים חולפים עשויים להתרחש בטווח שיכול לנוע בין אלפיות שנייה לשניות בהתאם לסוג התא ולתנאים הפיזיולוגיים24, תהליכים אחרים, כגון חלוקת תאים יכולים לדרוש שעות או ימים של צילום כדי להיות ניתנים לצפייה. בפרט, מחזור התאים של נקבות דרוזופילה GSCs לוקח בערך 12-14 שעות להשלים25. ב-Villa-Fombuena et al. (2021)8, אומדן משך המחזור השלם היה 15.5 שעות, כפי שנקבע על ידי חקר השינויים במורפולוגיה של הספקטרוזום. השילוב של שיטת הדמיה זו עם סמני כרומטין ו/או טכנולוגיית Fly-FUCCI26 הראה כי GSC מחולק בדרך כלל כל 15.5 שעות וכי משכי הזמן הממוצעים של שלבי מחזור התא היו: M (צורה עגולה, 22 דקות), G1 (צורות G1 עגולות, תקע ומוט, 3.45 שעות), S (צורת היתוך, 43 דקות) ו-G2 (היתוך, סימן קריאה וצורות עגולות, 10.5 שעות). נתונים גולמיים לגבי משך שלבי מחזור התא מוצגים ב-Villa-Fombuena et al.8. תצפיות אלו עלו בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהשתמשו בהדמיה קבועה כדי לנתח את מחזור תאי ה-GSC ומורפולוגיה של פיוזום25,27,28. יתר על כן, שיטת in vivo זו יכולה לעזור לפענח את ההשלכות במורד הזרם של חלוקת GSC חריגה ו/או דינמיקה ספקטרוזומית בבחירת הביציות במורד הזרם מכיוון שהפוזום ממלא תפקיד מרכזי באירועים אלה. יתר על כן, ניתן ליישם פרוטוקול זה כדי לנתח את קצב חלוקת ה-GSC במוטציות מבוססות או חדשות.
הרכישה המתמשכת של תמונות במשך שעות ארוכות מרמזת על סדרה של נושאים קריטיים שיש לקחת בחשבון, בעיקר שמירה על שלמות הרקמה ותפקודה ושימור הקרינה של הדגימה. שמירה על התנאים הסביבתיים המתאימים של תאי נישה חיונית כדי למנוע תקלות, לחצים, עצירת מחזור התא או מוות של תאים. בתנאים במחקר זה, GSCs יכולים להיכנס למיטוזה, שלב קריטי להצביע על בריאות הרקמות, גם לאחר 12 שעות או יותר בזמן הצילום. לפיכך, אנו משערים שגרמריה מתורבתת שומרת על שלמותה ותפקודה לאורך רוב זמן ההדמיה. באופן דומה, בגלל הייצור החדש של חומר GFP:Par-1 (ראה Villa-Fombuena et al. 2021)8 לאורך כל מחזור התא, ומכיוון שאנו מצמצמים את רכישת התמונה לאחת ל-10 דקות בלבד, אפילו נקודות הזמן הקרובות יותר לסוף הסרטים שומרות על מספיק אות כדי לאפשר את ניתוחם. בכל מקרה, ניתן לתקן הלבנת דגימה על ידי תוספים כגון תיקון אקונומיקה13.
כדי לחקות סביבה נכונה ex vivo, ניתן לשמור על רקמות חרקים באמצעות המדיום של שניידר למשך מספר מסוים של שעות במהלך הצילומים עם תוספים ספציפיים. חשוב לציין, פרוטוקול זה אינו משתמש בגורמי גדילה או בתמצית זבובים מלבד FBS. מחקר קודם הראה כי GSCs רבים נעצרים בדרך כלל ב-G2 ונכנסים לשלב M על ידי רמות אינסולין גבוהות25. לפיכך, איננו מוסיפים אינסולין לתנאי התרבית כדי למנוע גירוי חריג זה של מחזור תאי ה-GSC. הוספת FBS למדיום הדיסקציה יכולה גם להפחית את הסיכוי שתאי ביצים יידבקו לקצה הפיפטה או לצלחת הזכוכית במהלך העברת השחלות21. לבסוף, השימוש באנטיביוטיקה מתאים לסרטים ממושכים כדי למנוע התפשטות חיידקים ו/או פטריות. צמיחת יתר של מיקרואורגניזמים בכלי התרבות עלולה לשנות את ההומאוסטזיס של הרקמה ולכן להשפיע על חלוקת התאים. בפרוטוקול זה, המדיום מכיל תערובת של אנטיביוטיקה (בדרך כלל בתוספת של 1% (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). כמו כן, דגירה ארוכה עלולה להשפיע על יעילות האנטיביוטיקה, וניתן לשקול החלפת המדיום כדי למנוע ריקבון אנטיביוטי.
Drosophila germaria מוקפים במעטפת שריר צינורית שיש צורך להסיר כדי למנוע את התנועות הפריסטלטיות, המסתובבות וההתכווצות האופייניות לרקמה זו29,30. לפיכך, הסרת מעטפת שריר זו משפרת את התצפית על אותות מדווחים, מאפשרת שימוש בתצורות הגדרה קונפוקליות כדי למזער הלבנת אותות ונזקי אור, ומאפשרת תמונות ברזולוציה גבוהה. בצד החיסרון, התרומה של מעטפת השריר להומאוסטזיס של הרקמה עדיין לא ידועה. לפיכך, הסרתו עשויה להשפיע איכשהו על התפקוד התקין של נישת ה- GSC. חסרון נוסף של המערכת הוא שגרמריה עלולה להתנתק מהדבק במהלך הצילום ולהיסחף במדיום שמסביב. לכן, תמונות יכולות להשתנות בתוך נקודות זמן או אפילו במהלך רכישת סדרת z נתונה. אם זה המקרה, ניתן להשתמש בתוספים שונים כדי לתקן תנועה לדוגמה ב-ImageJ, כגון שיטות רישום12.
לסיכום, פיתחנו שיטה לרכישת סרטים מורחבים של גרמריה חיה. בעוד ששיטה זו אפשרה הגדרה מפורטת של מחזור תא ה-GSC וכיצד הדינמיקה של הספקטרוזום מתאמת עם השלבים השונים של מחזור התא GSC, אנו מודעים לכמה מהמגבלות הטמונות בפרוטוקול שלנו. בראש ובראשונה, רכישת התמונה מתרחשת במדיום מלאכותי שבו תנאי הסביבה אינם מסכמים בדיוק את תנאי ה-in vivo . עם זאת, מכיוון שהשגנו תוצאות דומות לגבי מורפולוגיה של ספקטרוזומים במהלך שלבי מחזור התא השונים מאלו שדווחו על ידי מחברים אחרים המשתמשים ברקמה קבועה31, אנו מאמינים שפרוטוקול זה מסכם במידה רבה את תנאי ה-invivo . שנית, בעוד שנראה כי שלמות הרקמה ותפקודה אינם מושפעים מהתרביות באורך 16 שעות, לא הערכנו זאת בקפידה. באופן אידיאלי, אפשר להשתיל גרמריה מצולמת בחזרה לבטן נקבה ולהעריך אם היא יכולה לייצר תאי ביצים חדשים כמו גרמריה ביקורת32. שיטת ההדמיה החיה המשמשת במחקר זה היא כלי רב ערך לניתוח החלוקה הא-סימטרית של GSC, במיוחד עבור ביולוגיה של שחלות דרוזופילה בכלל. בנוסף, גישה זו מתאימה במיוחד למחקרים פרמקולוגיים של תרכובות כימיות, גורמי גדילה או חומרים מזינים, מכיוון שניתן להשלים אותם ישירות באמצעי התרבית. יתר על כן, אנו יכולים למקם דגימות ניסוי ובקרה באותה צלחת, ולמזער את השינויים הטכניים בתוך הניסויים.

הדמיה חיה של תהליכים ביולוגיים היא חיונית להשגת ראיות ניסיוניות ישירות. השילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית מתקדמת ואופטימיזציה של מתודולוגיות מאפשר לחקור אירועים ביולוגיים מרובים בדיוק גבוה. אופטימיזציה של שלבים בפרוטוקולים כגון מניפולציה ודיסקציה של רקמות, הכנת ושימור דגימות, והגדרות רכישת מיקרוסקופיה היא קריטית כדי למקסם את האמינות והחוסן של התוצאות המתקבלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניטור דגימות להדמיה מורחבת, המתמקד במיוחד בשחלות Drosophila melanogaster. השחלה Drosophila melanogaster היא מערכת מודל מצוינת לניתוח של מגוון רחב של תהליכי התפתחות. בין רבים אחרים, איבר רבייה זה של זבוב הפירות Drosophila melanogaster מכיל נישה מוגדרת היטב של תאי גזע בוגרים. נישת GSC זו מקיימת את התפתחות הגמטות הנקביות במהלך הבגרות. שחלות הדרוזופילה מורכבות מכ -18 שחלות, בהן מתפתחים תאי ביצים בגרמריום. בקצה של כל גרמריום, 2-4 GSCs נשמרים בנישה תאית סומטית שנוצרת בעיקר על ידי נימה סופית של 8-10 תאים, שושנת של 5-8 תאי כובע ו-2-3 תאי ליווי קדמיים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A). נישה סומטית זו מספקת ל-GSCs אותות חיוניים ותמיכה פיזית כדי לשמור על הגזע שלהם, לשלוט בהתפשטות ולמנוע בידול1,2,3,4,5.
ה-GSCs מתחלקים בדרך כלל בצורה אסימטרית כדי ליצור תא גזע חדש ששומר על קשר עם הנישה הסומטית ותא הבת, הציסטובלסט (CB), שמאבד מגע ישיר עם תאי הכובע הסומטי ומתמיין. GSCs ו-CBs מכילים אברון דינמי וציטופלזמי ביותר, הספקטרוזום, שתפקידו העיקרי הוא הכיוון הנכון של הציר המיטוטי במהלך מיטוזה6. ה-CB מתחלק 4 פעמים עם ציטוקינזיס לא שלם כדי לפתח ציסטות של 16 תאים, כאשר אחד מתאי קו הנבט מציין לתוך הביצית ו-15 התאים האחרים הופכים לתאי אחות. ספקטרוזום ה-CB גדל למבנה מסועף הנקרא פוזום המחבר את תאי קו הנבט המחוברים זה לזה של 16 תאים. הספקטרוזום מועשר בשלפוחיות קטנות וחלבוני שלד כגון סרין-תראונין קינאז Par-1 ורכיב הממברנה Hu-li tai shao (Hts)7. במהלך מחזור תא ה-GSC, הספקטרוזום גדל על ידי הוספת חומר חדש ומשנה את צורתו, מה שמאפשר זיהוי של שלבי G1, S, G2 ו-M (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1B)8,9.
לאחרונה יישמנו שיטת תרבית ex vivo של גרמריום דרוזופילה המאפשרת הדמיה של GSCs חיים עד 16 שעות. מכיוון שתאים אלה מתחלקים אחת ל-15.5 שעות בממוצע8, שיטה זו מאפשרת צילום של חלקים גדולים ממחזור תאי ה-GSC. לפיכך, בשילוב עם כלים אחרים, שיטת התרבות שלנו אפשרה תיאור של מורפולוגיה ספקטרוזומית במהלך מחזור התא GSC וניתוח משך שלבי מחזור התא השונים in vivo8 (איור 1C). כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של שיטת הדמיה חיה מורחבת זו הנתמכת על ידי וידאו מונחה צעד-אחר-צעד המתאר את המתודולוגיה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2).

<table><tbody><tr><td>צלחת זכוכית 9 בארות</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot; 2H2O; להכנת הפתרון של רינגר</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>דבק תאים ורקמות המשמש לחיבור תאים או קטעי רקמה לסוגים רבים של משטחים, כולל פלסטיק, זכוכית, מתכת, פולימר FEP וחומרים ביולוגיים.</td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>מידות 0.05 מ"מ x 0.02 מ"מ ואורך 11 ס"מ</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>מוסמך, מושבת בחום, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מוצא דרום אמריקה&nbsp;</td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>צלחת 35 מ"מ, מס' 1.5 כיסוי, קוטר זכוכית 10 מ"מ, &nbsp; מצופה פולי-D-ליזין</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>להכנת תמיסת רינגר</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M1028</td><td>MgCl<תת>2; להכנת הפתרון של רינגר</td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>קל משקל, ידית נירוסטה חלולה; אורך 4 3/4 אינץ'.</td></tr><tr><td>ניקון SMZ18 דו-עיני&nbsp;</td><td>ניקון</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15140122</td><td>10,000 יח'/מ"ל</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3911</td><td>KCl; להכנת התמיסה של רינגר</td></tr><tr><td>שניידר Drosophila Medium</td><td>Biowest&nbsp;</td><td>L0207</td><td>מדיום תרבית תאים לתאי חרקים</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; &ge; 99.5%, אבקת</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; להכנת התמיסה של רינגר</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9378</td><td>&ge; 99.5% (GC); להכנת הפתרון של רינגר</td></tr><tr><td>מחט דיסקציה טונגסטן</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0.25 מ"מ, דק במיוחד, קצה 1 מיקרון (Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>לביולוגיה מולקולרית, אבקת שמרים נוזלית צמיגה</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות drosophila melanogaster

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

שיטות הדמיה חיות מאפשרות ניתוח של תהליכים תאיים דינמיים בפירוט ובזמן אמת. שחלת הדרוזופילה מייצגת מודל מצוין לחקר הדינמיקה של מספר עצום של תהליכים התפתחותיים, כגון חלוקת תאים, גזע, התמיינות, נדידה, אפופטוזיס, אוטופגיה, הידבקות תאית וכו', לאורך זמן. לאחרונה, יישמנו תרבות ex vivo מורחבת והדמיה חיה של נישת ה-GSC הנשית של דרוזופילה. באמצעות קו דרוזופילה המכיל טרנסגן GFP::P ar-1 כדוגמה, שיטה זו מאפשרת הדמיה של החלוקה הא-סימטרית של ה-GSCs בתוך הנישה שלהם ותיאור השינויים במורפולוגיה של הספקטרוזום לאורך מחזור התא. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבות ex vivo של Drosophila germaria, המאפשר הדמיה ממושכת של נישת ה-GSC הנשית. חשוב לציין, פרוטוקול זה ישים באופן נרחב להדמיה חיה של GSCs עם מספר חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים מעניינים הזמינים במרכזי מלאי ו/או בקהילת המחקר של דרוזופילה.

באמצעות פרוטוקול דימוי חי מורחב זה, אנו יכולים להקליט את המיטוזה האסימטרית של GSCs נקביים בתוך הנישה שלהם ללא הפרעות ביולוגיות ניכרות. לשם כך, אנו משתמשים ב-germaria המבטאים באופן גלובלי את החלבון GFP::Par-1, המבחין בין חמישה מורפולוגיות נפרדות של הספקטרוסום לאורך מחזור התא של ה-GSC: עגול (Round), פקק (Plug), מוט (Bar), איחוי (Fusing), וסימן קריאה (Exclamation point) (איור 1B,C). בתיאור מפורט יותר, הבחנו כי אות ה-GFP:Par1 החזק של ספקטרוסום Round-G2 (איור 1C, פאנל a) פוחת באופן דרמטי במהלך השלבים G2-M-G1. חשוב לציין, השימוש בקו טרנסגני זה מאפשר גם ויזואליזציה של כניסת ה-GSC למיטוזה, מכיוון שרוב ה-GFP::Par-1 עוזב את הספקטרוסום וממלא את הציטופלזמה במהלך הפרופאזה המוקדמת (איור 1C, פאנל b). בנוסף, GFP::Par-1 ציטופלזמי מאפשר זיהוי מדויק של שלב חדירת המעטפת הגרעינית (NEP)8,14, שכן אות ה-GFP נכנס לנוקלאופלזמה ברגע המדויק הזה (איור 1C, פאנל b). לאחר המיטוזה ובנייה מחדש של המעטפת הגרעינית, אות ה-GFP:Par1 משתחזר בהדרגה בספקטרוסום Round-G1 (איור 1C, פאנל c). הוספה De novo של חומרי GFP:Par1 לספקטרוסום Round-G1 מקדמת את היווצרות המורפולוגיות של ספקטרוסום Plug (איור 1C, פאנל d), Bar (איור 1C, פאנל e), ו-Fusing (איור 1C, פאנל f). לבסוף, סמן ה-GFP:Par1 מאפשר ויזואליזציה של ספקטרוסום סימן קריאה (Exclamation point) (איור 1C, פאנל e), כתוצאה מהיווצרות ה-midbody, מבנה חלבוני עשיר במיקרוטובולים הנוצר במהלך הציטוקינזה בנוסף לטבעת ה-actomyosin המתכווצת.
<img alt="שלבי התמיינות תאי גבעול של רצף הנבט; מורפולוגיית הספקטרוסום; תרשים שלבי המחזור; מיקרוסקופיה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="איור 1"> 
איור 1: דינמיקת מחזור הספקטרוסום ב-GSCs חיים. (A) תרשים סכמטי של נישת תאי הגבעול של רצף הנבט (GSC niche) המורכבת מתאי סיב טרמינליים (TFCs, בכחול), תא מעבר (TC, באדום), תאי כיפה (CpCs, בסגול), ותאי ליווי (ECs, באפור). ה-GSCs (בצהוב) מכילים אורגנלה אופיינית הנקראת ספקטרוסום (בסרוק). במהלך מחזור התא של ה-GSC, הספקטרוסום משנה את צורתו מצורה כדורית לצורה מוארכת ואז שוב לכדור. ה-GSC מתחלק כדי לייצר תא בת, הציסטובלסט (CB, בכתום), שמאבד מגע עם הנישה ומכיל גם הוא ספקטרוסום כדורי. ה-CB מתחלק ארבע פעמים רצופות ובסנכרון עם ציטוקינזה חלקית כדי להפיק ציסטות של 2, 4, 8 ו-16 תאים המחוברות ביניהן על ידי הפוזום. (B) תרשים המייצג את צורות הספקטרוסום השונות הנוצרות במהלך מחזור התא. (B') הזמן הצפוי לצפייה במורפולוגיות של הספקטרוסום. (C) תמונות מנקודות זמן של סרטון באורך 17 שעות המראה אות של GFP::Par-1 בנישת ה-GSC. זמן 0 דקות (0') תואם לחדירות מעטפת הגרעין (NEP). הפאנל ממחיש חמש מורפולוגיות שונות של הספקטרוסום (חצי חצים לבנים וירוקים): עגול (הן ב-G2 והן ב-G1; פאנלים a ו-c), פקק (פאנל d), מוט (פאנל e), התמזגות (פאנל f), וסימן קריאה (פאנל e, חץ ירוק). מורפולוגיית הספקטרוסום האחרונה שייכת ל-GSC השני (קו מקווקו ירוק) המוצג בדקה ה-70'. GSCs מוגבלים על ידי קווים מקווקווים בצהוב ובירוק. ה-CBs הנוצרים לאחר חלוקת ה-GSC מוגבלים בקווים מקווקווים בכתום. סרגל קנה מידה: 10 µm. פאנלים A ו-B הותאמו באישור מ-Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשים בידוד אובריול של Drosophila; שלבים: הכנת MatTek, דיסקציה, דימוי; שיטה ביולוגית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="איור 2"> 
איור 2: שיטת קיבוע באמצעות דבק Cell-Tak לצורך דימוי חי ממושך של גרמריה של Drosophila. (1) תהליך שלב אחר שלב להכנת צלחת עם תחתית זכוכית עם הדבק. (2) סקירה כללית של דיסקציה של שחלה של Drosophila בתמיסת Ringer והכנת אובריול בודד ללא שרירים. (3) העברת האובריול ללא מעטפת השרירים אל הצלחת בעלת תחתית הזכוכית. (4) מילוי הצלחת בעלת תחתית הזכוכית במצע Schneider מועשר. (5) דימוי של הגרמריה במשך 10 h עד 16 h באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. איור זה הותאם באישור מ-Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

extended-live-imaging-female-drosophila-melanogaster-germline-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכי העוצמה פלורסצנטיות ערכי pH.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

כאן, אנו דנים בתהליך עבודה להכנה, ניתוח, הרכבה ותמונה של מוחות צמחים חיים מזחלי Drosophila melanogaster Third instar כדי לצפות בדינמיקה התאית והתת-תאית בתנאים פיזיולוגיים.

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

למד הדמיה חיה של תאי גזע נקבתיים ב-Drosophila melanogaster באמצעות שילוב GFP לחלבון Par-1. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר חלוקת תאים ודינמיקת ספקטרוזום במחזור התא המלא.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

גלה סרטונים נוספים