אפיון ספקטרום בליעה ביולוגי מהגלוי ועד האינפרא אדום קצר הגל
10 בינואר 2025
לדגימות ביולוגיות יש מאפיינים אופטיים מובהקים בתחום האינפרא-אדום הקצר (SWIR) בהשוואה לטווח אורכי הגל הנראה (VIS) והאינפרא-אדום הקרוב (NIR). עם זאת, רישום ספקטרום בליעת SWIR טהור הוא מאתגר ולעתים רחוקות מתבצע עבור מולקולות ביולוגיות. מאמר זה מציג שיטה לאפיון ספקטרום הבליעה VIS-SWIR של בולמים ביולוגיים.
המעבדה שלנו מפתחת כלים מבוססי אור המספקים מידע אבחוני עבור יישומי בריאות האם. לעתים קרובות אנו משתמשים בספקטרוסקופיה אופטית בגלל שפע המידע הבריאותי שהיא יכולה לספק באופן לא פולשני, כגון ניטור חמצון הדם וריכוז המוגלובין, שניהם פרמטרים פיזיולוגיים חשובים לניטור במהלך ההריון. לחלק מהממיסים במים חלקיקיים יש ספיגה חזקה שיכולה להאפיל על המומסים המעניינים.
יתר על כן, לספקטרום המשתרע על פני אזור VIS-SWIR יש לעתים קרובות הבדלים גדולים בבליעה בטווחי אורכי גל שונים, ועלינו לשנות הגדרות ניסוי עבור אזורים שונים כדי לקבל ספקטרום SNL גבוה. הקושי ברכישת ספקטרום ביולוגי VIS-SWIR תרם לספקטרום בליעה ביולוגי מוגבל שפורסם, ואנו שואפים לפשט תהליך זה. בנוסף, הבנה משופרת של המאפיינים הספקטרליים הספציפיים של כל רכיב ביולוגי תסייע לבחור אורכי גל אופטימליים שיכולים למזער את הטיית הפיגמנטציה של העור הנגרמת על ידי ספיגת מלנין חזקה.
אנו מקווים שהפרוטוקול שלנו יאפשר לחוקרים להרחיב את ספריית VIS-SWIR הנוכחית של בולמים ביולוגיים. תוצאות אלה גם מדגישות את ההשפעה של מלנין על התקנים אופטיים כפונקציה של אורך גל וניתן להשתמש בו כדי לתכנן מערכות עם הטיית פיגמנטציה מינימלית בעור, כגון SWIR. כדי להכין את דגימת המוגלובין מחומצן עם דם אנושי שלם heparinized, פיפטה 1.8 מיליליטר של דם לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו.
צנטריפוגו את הצינור במשקל 9.6 גרם למשך 10 דקות, והשליכו כ-850 מיקרוליטר של סופרנאטנט מבלי להפריע לכדור. החזירו את הגלולה לכ-850 מיקרוליטר מים מפורקים, וצנטריפוגה שוב במשקל 9.6 גרם למשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, כדי ליזה תאי דם אדומים, לבנות מחדש את כדוריות תאי הדם האדומים עם 4.5 מיליליטר של מים deuterated.
אם הגלולה נצמדת לצינור, יש לשטוף עם חלק מהמים כדי לשחרר אותה. באמצעות מחט קצה קהה מזרק, להסיר את תמיסת הדם lysed מן הצינור. לאחר מכן נתקו את מחט החוד הקהה מהמזרק, והשליכו אותה למיכל חדים מסוכן ביולוגית.
לאחר מכן, חברו מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר למזרק, וסננו את התוכן לאורך נתיב של 10 מילימטר, זכוכית 3.5 מיליליטר או קובטת קוורץ. אבטחו את הקובטה עם פקק אטום למניעת זיהום. יש לעטוף את הפרפילם סביב הפקק כדי להבטיח אטימה אטומה לחלוטין.
הכינו הפניה על ידי מילוי קובטה נקייה באותו נתיב, אורך ונפח, במים מיובשים למדידות קו בסיס וייחוס. כדי להכין את דגימת המוגלובין deoxygenated, להוסיף dithionite נתרן לתמיסת הדם בקובט. הדקו את הקובטה עם פקק אטום ועטפו את הפרפילם סביב הפקק כדי להבטיח אטימה אטומה.
בזהירות להטות את קובטה מצד לצד עד dithionite נתרן מומס לחלוטין. שימו לב לשינוי הצבע של תמיסת הדם מאדום לאדום סגול כהה יותר. כדי להתחיל, הפעל את מנורת הספקטרומטר ואת הגלאים, המאפשר למערכת להתחמם במשך 5 עד 20 דקות.
נקו את הקוביות עם אתנול באמצעות Kimwipe. עבור ספקטרומטר של קרן כפולה, מקם קוביטות מלאות במים מפורקים כתמיסת ייחוס הן בתא הדגימה והן בתאי הייחוס. בחר את טווח אורכי הגל המתאים ואת הגלאי בהתבסס על האזור הספקטרלי שיש למדוד.
קבל מדידות ייחוס באמצעות פרמטרי ברירת המחדל. לאחר מכן, להחליף את cuvette בתא הדגימה עם cuvette המכיל המוגלובין מחומצן. עברו למצב חי כדי להציג את הספיגה ברציפות בזמן כוונון פרמטרי המדידה.
החל מפרמטרי ספקטרומטר ברירת המחדל, התאם את הקריאות לכל נתון ורוחב פס כדי לקבל ספקטרום בליעה נקי איכותית ללא רוויה. אם שינוי עוצמת אור האירוע, רוחב הפס, זמן החשיפה והקריאות לכל נתון אינו גורם לספקטרום גבוה של יחס אות לרעש, שנה את ריכוז הדגימה, והצב את קוביטת הייחוס בתא הדגימה או הייחוס או באורך הנתיב של הדגימה וההפניה כדי לקבל ספקטרום גבוה של יחס אות לרעש. לאחר מיטוב ההגדרות לדגימה, תעדו את ההגדרות עבור כל ספקטרום שנרכש.
באמצעות ההגדרות הממוטבות, מדדו מחדש באמצעות אותן הגדרות עם פתרון הייחוס בתאי ההפניה והדגימה כדי לקבל את מדידת הייחוס הממוטבת. לאחר מכן, החלף את קוביית הייחוס בתא הדגימה בקובט דגימת המוגלובין מחומצן, ובצע מדידת דגימה אופטימלית. שמור בנפרד את מידות ההפניה והדוגמה.
באמצעות המשוואה הבאה, חשב את הספיגה A על ידי התייחסות למדידת הייחוס כ- I0 ולמדידת הדגימה כ- I.לצורך עיבוד שלאחר העיבוד, פתח תוכנת ניתוח נתונים כגון MATLAB, וטען את מדידות הספיגה שנרכשו מאזורים שונים של הספקטרום. החל מקדם כפל על אזור ספקטרלי אחד כדי לתפור יחד אזורים שונים עם ריכוזי דגימה או אורכי נתיב משתנים. ספקטרום ההמוגלובין המחומצן הראה מתאם חזק עם ספקטרום שפורסם על ידי Prahl, עם שיאי בליעה מובהקים של 415 ננומטר והכפלה בין 540 ל 575 ננומטר באזור הנראה, יחד עם תכונת בליעה רחבה בין 800 ל -1, 100 ננומטר באינפרא אדום הקרוב.
באזור האינפרא אדום הגל הקצר. ספקטרום ההמוגלובין המחומצן הראה ספיגה נמוכה, ככל הנראה בשל תכולת המים השיורית. ספקטרום ההמוגלובין הלא מחומצן הראה מתאם חזק עם הספקטרום של פראהל, הכולל פסגות בולטות ב 430 ננומטר, 560 ננומטר, ו 760 ננומטר, ופסגות קטנות יותר סביב 1, 200 ננומטר, ובין 1, 400 ל 1, 600 ננומטר.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לאפיון ספקטרומי בליעת VIS-SWIR של בולעי אור ביולוגיים, תוך התייחסות לאתגרים בהקלטה של ספקטרומי SWIR טהורים. המחקר שואף לשפר את ההבנה של המאפיינים הספקטרליים של דגימות ביולוגיות, במיוחד באבחון בריאות האישה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ספקטרוסקופיה אופטית
- ספקטראבליציית בליעה ביולוגית
- דיאגנוסטיקה של בריאות האם
רקע
- דגימות ביולוגיות מציגות מאפיינים אופטיים שונים בטווחי אורכי גל שונים.
- הקלטה של ספקטרומי בליעה ב-SWIR עבור מולקולות ביולוגיות נערכת לעיתים רחוקות.
- המספר המוגבל של ספקטרומי בליעה ביולוגיים שפורסמו מעכב את התקדמות המחקר.
- הבנת המאפיינים הספקטרליים יכולה לצמצם הטיות במדידות אופטיות.
מטרת המחקר
- לפישוט התהליך של רכישת ספקטרומים ביולוגיים בטווח VIS-SWIR.
- להרחבת הספריה של בולעי קרינה ביולוגיים באזור VIS-SWIR.
- לשיפור כלים אבחנתיים עבור יישומים לבריאות האימא.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות של המוגלובין מחומצן ומותיר חמצן מדם אנושי.
- שימוש בספקטרומטר בעל קרן כפולה למדידת ספקטרא של בליעה.
- אופטימיזציה של הגדרות הניסוי להשגת ספקטרא עם יחס אות לרעש גבוה.
- עיבוד נתונים לאחר המדידה באמצעות תוכנות כגון MATLAB לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- ספקטרום ההמוגלובין המחומצן תאם לנתונים שפורסמו, והראה שיאי בליעה מובחנים.
- ספקטרום ההמוגלובין שאינו מחומצן הראה אף הוא מתאמים חזקים עם ספקטרומים ידועים.
- התוצאות הדגישו את השפעת המלנין על מדידות אופטיות באורכי גל שונים.
- שיטות מותאמות עשויות לסייע בהפחתת הטיות הנובעות מפיגמנטציה של העור באבחון אופטי.
מסקנות
- המחקר מספק פרוטוקול לשיפור רכישת ספקטרומי בליעה ביולוגיים.
- הבנה משופרת של מאפיינים ספקטרליים יכולה לסייע בפיתוח כלי אבחון טובים יותר.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על עבודה זו כדי לחקור עוד יותר יישומים של VIS-SWIR בביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
אפיון מדויק של ספקטרומי בליעה ביולוגיים מאור נראה ועד לאינפרה-אדום בעל גלים קצרים (VIS-SWIR) הוא קריטי לפיתוח אמצעי אבחון אופטיים לא פולשניים עם מינימום הטיות הנובעות מפיגמנטציה של העור. יכולת זו משפיעה ישירות על הביטחון החזוי ועל השمولיות של כלי ניטור פיזיולוגיים מבוססי אור, במיוחד באוכלוסיות בעלות גווני עור מגוונים. ספריות ספקטרליות משופרות של רכיבי רקמה מאפשרות תכנון מכשירים חסון יותר והמשכיות תרגומית לכלל תיק הפיתוח במחקר ופיתוח בביו-פרמה (biopharma R&D).&ד'.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר זיהוי מדויק של אורכי גל אופטימליים לבדיקת רכיבי רקמה במבחנים בשלב הגילוי.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת התרומה הספקטרלית של hemoglobin, melanin, מים ושומנים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הפחתת גורמים מבלבלים הנובעים מבליעה הקשורה לפיגמנטציה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק נתונים ספקטרליים מתוקתקים לסטנדרטיזציה של פלטפורמות בדיקה אופטיות בטווחים של VIS-SWIR.
- משפר את השחזוריות ואת הפלט הכמותי על ידי אופטימיזציה של יחסי אות-רעש במדידות ספקטרליות.
- מאפשר תהליכי סריקה ניתנים להרחבה (scalable) על ידי מתן מידע לבחירת אורכי גל עבור סוגי רקמות מגוונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תכנון המכשיר האופטי לזיהוי סמנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה והמייצגים את האוכלוסייה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מזעור הטיות מדידה הנובעות מפיגמנטציה של העור.
- מפחית את הסיכונים של קידום תרגומי על ידי אספקת ניגודיות חזקה ללא סימון עבור סופגים מרכזיים ברקמות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו לאפיון ספקטרלי משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר תרגומי, ותומכת בזיהוי מובילים ובתיקוף פרה-קלניני.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרה של מסלולים על ידי בידוד מאפייני ספיגה של רכיבי רקמה מרכזיים.
- סריקה: מספקת פלטים ספקטרליים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות וסטנדרטיזציה של פלטפורמות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ספיגה ברמת דיוק גבוהה וספקטרומים מחוברים לניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מבטיח התאמה של סממנים ביולוגיים ושוויון במדידה בקרב אוכלוסיות מגוונות.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים ספרייה ספקטרלית לשימוש חוזר עבור יוזמות שוטפות לפיתוח מכשירים ובדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבוי ומפחית עמימות מכניסטית בזיהוי סממנים ביולוגיים אופטיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של רכישה ואנליזה ספקטרלית לצורך הדירות וסקלביליות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך תהליך (go/no-go) ויעילות הון על ידי אפשור דיאגנוסטיקה בלתי מוטה הכוללת אוכלוסיות מגוונות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודוף מותאם סיכון ובקידום של פלטפורמות דיאגנוסטיות אופטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרוסקופיה אופטית ובניתוח נתונים ספקטרליים.
- נדרשת גישה לספקטרומטרים בעלי קרן כפולה ותוכנה לעיבוד נתונים (למשל MATLAB).
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדאית של פרוטוקולי הכנת הדגימות והמדידה בין הצוותים השונים.
- יש להתאים את ההגדרות לאזורים ספקטרליים שונים ולריכוזים משתנים של רכיבי רקמה.
- מגבלות רגישות של החומרה באורכי גל ארוכים יותר עשויות להגביל יישומים מסוימים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:28
Preparation of Oxygenated and Deoxygenated Hemoglobin Samples from Whole Heparinized Human Blood for Spectral Analysis
3:12
Preparation of Deoxygenated Hemoglobin Samples
3:45
Optimizing Visible, Near-Infrared, Short-Wave Infrared Absorbance Measurements for Hemoglobin Samples
6:32
Representative Results
