Name: גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למד שיטת גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס לניתוח מקיף של הגליקופרוטאום בסביבות גידול סרטניות מורכבות. השיטה מספקת תובנות מדויקות לחקר גליקוביולוגיה של סרטן וזיהוי ביומרקרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>יצירת פרופיל של רקמות סרטן המעי הגס באמצעות גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס

גליקוזילציה של חלבונים היא סוג נפוץ ומורכב של שינוי משותף ולאחר תרגום של חלבונים המיוצרים על ידי מינים ברחבי עץ החיים הפילוגנטי 1,2,3. הגליקנים הקשורים לחלבון ידועים כמשפיעים על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים החשובים לבריאות האדם, כולל תיווך וויסות של אינטראקציות תאיות ואירועי תקשורת 4,5. גליקוזילציה של חלבון חריג נחשבה כגורם לשינוי ממאיר, התקדמות הגידול והתפשטות 6,7,8. זה מסבך גליקנים בתהליכים גידוליים מרכזיים במיקרו-סביבה של הגידול (TME) ומציע פוטנציאל ניכר ובלתי מנוצל במידה רבה לגילוי סמנים ביולוגיים מבוססי גליקן ויישומים טיפוליים. הגליקוביולוגיה זוכה, אם כן, לתשומת לב הולכת וגוברת בחקר הסרטן ובמדעי החיים9.
מופעל על ידי התפתחויות מרכזיות בגליקואנליטיקה ואינפורמטיקה במהלך העשור האחרון 10,11,12,13,14,15,16,17, גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה מונעת כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) נקבעו ככלים רבי עוצמה ליצירת פרופיל מערכתי של גליקנים משוחררים וגליקופפטידים שלמים מתערובות מורכבות של גליקופרוטאינים המופקים ישירות ממקור הדגימה הביולוגית שלהם, כגון סוגים שונים של דגימות חולי סרטן (למשל, רקמות גידול, אוכלוסיות תאים, נוזלי גוף)3,13,18,19,20.
גליקומיקס מספק מידע על המבנה והכמות של רפרטואר הגליקן (הגליקום), אשר מיוצר באופן דינמי על ידי תאים, רקמות ואפילו אורגניזמים שלמים. מצד שני, גליקופרוטאומיקה מספקת מידע כמותי על נשאי החלבונים ואתר(י) הגליקוזילציה שלהם, שיעורי התפוסה באתר (מאקרו-הטרוגניות), הרכבי הגליקן הספציפיים לאתר ותבנית התפלגות האתר שלהם (מיקרו-הטרוגניות) עם מידע מבני גליקני מוגבל (לעתים קרובות מוגבל להרכב גליקן)15,16,21. לפיכך, גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה הן גישות משלימות לסקירת הפרטים הביוכימיים של הגליקופרוטאום22.
מספר עצום של עיצובים מתודולוגיים ואסטרטגיות אנליטיות עבור גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה פותחו ויושמו במעבדות שונות בהתאם לגליקואנליטית המעניינת (למשל, N-/O-/C-linked, גליקן/גליקופפטיד/גליקופרוטאין, מסומן/לא מסומן), אופי הדגימה (למשל, תאים, רקמות, נוזלי גוף), כמות (רמות ננוגרם/מיקרוגרם/מיליגרם חלבון) והמכשיר האנליטי הזמין23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. למרות היתרונות המוכרים של השימוש המקביל בהם, גליקומיקס וגליקופרוטאומיקה אינם מיושמים בדרך כלל יחד אלא כגישות עצמאיות במחקרים גליקוביולוגיים ומחקרי סרטן בשל הביקוש הגבוה שלהם למומחיות אנליטית ומכשור מיוחד.
מתוך הכרה בפער טכנולוגי זה, הצגנו לפני יותר מעשור את שיטת הגליקופרוטאומיקה בסיוע גליקומיקה, המסוגלת לשלב נתוני גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה המתקבלים מדגימות ביולוגיות מורכבות33. בקיצור, טכנולוגיית הגליקופרוטאומיקה בסיוע גליקומי (או מונחה גליקומיקה כמו בפרוטוקול זה) יוצרת פרופילים של N- ו / או O-גליקנים באמצעות שיטת פחמן נקבובי מבוסס (PGC) LC-MS/MS34,35, אשר משמשים לאחר מכן לניתוח נתונים שלמים N- ו / או O-glycopeptide המתקבלים מאותן דגימות על ידי הגדרת גבולות מרחב החיפוש גליקן36. PGC-LC-MS/MS היא שיטה גליקומית חזקה במיוחד מכיוון שהיא מספקת תובנה כמותית לגבי הגליקום עם רגישות גבוהה ורזולוציה מבנית, ומניבה מידע על טופולוגיה (רצף חד-סוכרי ותבנית הסתעפות) וקשרים גליקוזידים של גליקנים אפילו בתוך תערובות מורכבות 35,37,38. תהליך העבודה של הגליקופרוטאומיקה כולל ייצור פפטידים, תיוג פפטידים אופציונלי, ריבוב ופרה-פרפרקציה, כמו גם העשרה לפני ניתוח LC-MS/MS בשלב ההפוך שבאופן אידיאלי משתמש בשיטות פיצול שונות, כולל אנרגיית התנגשות מדורגת / דיסוציאציה התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (sceHCD, עבור N-גליקופפטידים) ודיסוציאציה של העברת אלקטרונים/התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (EThcD, עבור O-גליקופפטידים) לזיהוי אנליטי. עבור ניתוח N-glycoproteome, de-N-glycoproteomics מקבילים יכולים להנחות את ניתוח הנתונים N-glycopeptide שלם על ידי הגדרת מרחב החיפוש חלבון/פפטיד ועל ידי מתן פרטים נוספים על אתרי N-glycosylation הכבושים וקצב התפוסה שלהם באתר, בעוד הניתוח המקביל של פפטידים שלא השתנו מגלה כל שינוי ברמת החלבון בין התנאים הנחקרים.
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט וקל למעקב שלב אחר שלב עבור שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקס (ראו איור 1 לסקירה כללית של זרימת העבודה). הפרוטוקול מספק פרטים ניסיוניים של שלבי הכנת הדגימה וניסויי גליקומיקס וגליקופרוטאומיקה מבוססי LC-MS/MS ומציג תוצאות מייצגות המדגימות את יישום השיטה על חלקי רקמה משובצים פרפין קבוע פורמלין (FFPE) של גידולים שנכרתו מחולי סרטן המעי הגס (CRC), ומאפשר תובנות לגבי הגליקוביולוגיה של TME בסוג דגימה יקר ערך המאוחסן בביובנקים של סרטן ברחבי העולם. ניתוח ואינטגרציה של נתוני גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה נדונים גם הם בקצרה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
איור 1: סקירה כללית של שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה. הסקירה מציגה שלבים ניסיוניים מפורטים בתהליכי עבודה גליקומיים (משמאל) וגליקופרוטאומיקה (מימין), עם סקירה כללית של המידע המתקבל (מודגש) וכיצד שתי הגישות משולבות באמצעות ניתוח נתונים ופרשנות משופרים. הוספה: מיקרו-עמודות SPE תוצרת בית המשמשות לתהליכי העבודה של גליקומיקה (i) ו- (ii-iii) גליקופרוטאומיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט, טוהר &ge; 99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>אצטוניטריל נטול מים (ACN), LC-MS</td><td>דרגת Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>חומצה פורמית, דרגת LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>יודואצטמיד (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>פפטיד-N-גליקוזידאז F (PNGase F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu; L) מתבטא רקומביננטית ב-Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון 40 (PVP)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>PVP40</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>484016</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>טריפסין חזירי בדרגת ריצוף&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>טריאתילאמוניום ביקרבונט (TEAB),</td><td>חלופות</td>זמינות <td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td> בדרגת LC-MS</tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית (TFA),</td><td>חלופות</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>זמינות Sigma Aldrich T6508 בדרגת LC-MS<חזקים>כלים/חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 דיסקים</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>C8 דיסקים</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>פלטת פוליפרופילן שטוחה 96 בארות&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>אימובילון-PSQ פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ממברנה</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td>גודל נקבוביות: 0.45 &mu; מ&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>מתאמי מיקרוצנטריפוגה&nbsp;</td><td>The Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin צווארון עמודים, מגיע עם עמודי Microspin</td></tr><tr><td>שרף Oligo R3</td><td>תרמו</td><td></td><td>1133903 גודל חלקיקים 30 &mu; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>חלבון LoBind צינורות 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>חלבון LoBind צינורות 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>מנקב חור יחיד</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>רכז SpeedVac</td><td>מרטין קרייסט</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>Supelclean שרף ENVI-Carb SPE</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>גודל חלקיקים 120-400 רשת. ניתן להפיק שרף באופן ידני ממחסניות, וניתן לאחסן אותו לטווח ארוך ב-50% (v/v) מתנול במזרק מים MilliQ</td></tr><tr><td>5 מ"ל</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>חממה מבוקרת טמפרטורה</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>שרף ZIC-HILIC</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>גודל חלקיקים/נקבוביות, 5 &mu; m/200 &Aring;. ניתן לחלץ שרף באופן ידני מעמודת LC, וניתן לאחסן אותו לטווח ארוך ב-50% (v/v) מתנול</td></tr><tr><td>במיקרו-עמודות מיצוי שלב מוצק (SPE) של מים MilliQ&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>לחלופין, מיקרו-עמודות C18-SPE תוצרת בית יכולות להחליף מוצר מסחרי</td></tr><tr><td><חזק>LC-MS/MS ניתוח</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 מערכת HPLC נימית אינפיניטית&nbsp;</td><td>חלופות</td> <td>Agilent</td><td></td> זמינות</tr><tr><td>עמודת LC אנליטית ארוזה מראש עם שרף ReproSil-Pur C18 AQ</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, גרמניה</td><td>r13.aq.s2570</td><td>גודל חלקיקים/נקבוביות: 3 &mu; m/120 &Aring;, אורך/קוטר פנימי: 25 ס"מ/75 &mu;m. ניתן להשיג גם עמודות ננו-LC מסחריות C18/&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC&nbsp;</td><td>חלופות</td> <td>תרמו</td><td></td> זמינות</tr><tr><td>עמודת LC נימית HyperCarb KAPPA PGC&nbsp;</td><td>תרמו</td><td>הופסק</td><td>גודל חלקיקים/נקבוביות, 3 &mu; m/250 &Aring;; אורך עמוד, 30 מ"מ; קוטר פנימי, 0.180 מ"מ. גיאומטריות גדולות יותר של עמודות HyperCarb PGC-LC, המפיקות נתונים באיכות דומה זמינות מסחרית (למשל, Thermo #35003-031030). עמודת SupelTMCarb LC מבית Merck עם גודל חלקיק/נקבוביות, 2.7 &mu; m/200 ועם אורכי עמודות וקוטר פנימי שונים זמינים גם כן (למשל, Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>LiChrosolv 100029</td><td></td> בדרגת LCMS <td>חלופות זמינות</td></tr><tr><td>מלכודת ליניארית מרובעת (LTQ) ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים Velos Pro (גליקומיקה)&nbsp;</td><td>חלופות</td> <td>תרמו</td><td></td> זמינות</tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)</td><td>Thermo</td><td></td><td>מערכות MS אחרות ברזולוציה גבוהה עם או בלי ETD (נדרש רק עבור O-glycoproteomics) זמינות גם כן (למשל, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker או ספקטרומטרי מסה דומים בעלי ביצועים גבוהים מספקים אחרים)</td></tr> <tr><td>בקבוקוני בורג זכוכית שקופה Total Recovery 0.9 מ"ל</td><td>חלופות Thermo</td><td>THC11093563</td><td>זמינות</td></tr><tr><td>התאוששות מוחלטת בקבוקוני בורג זכוכית שקופים כובעים תואמים</td><td>Thermo</td><td>THC09150869</td><td>חלופות זמינות</td></tr> עמוד <tr><td>LC מלכודת ארוז בבית עם שרף ReproSil-Pur C18 AQ&nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, גרמניה</td><td>r15.aq.s0202</td><td>גודל חלקיקים/נקבוביות: 5 &mu; m/120 &Aring;, אורך/קוטר פנימי: 2 ס"מ/100 &mu;m. עמודי LC מסחריים C18 מלכודת זמינים גם כן.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 ומעלה</td><td>מנוע חיפוש מסחרי של גליקופפטיד ו-PTM, המקבל נתונים גולמיים של LC-MS/MS מרוב ספקי MS</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 ומעלה</td><td>תוכנה מסחרית לבדיקה ידנית של מועמדים לגליקופפטיד והערות אוטומטיות של ספקטרום MS/MS גליקן</td></tr><tr><td>GlycoMod</td> תוכנת גישה פתוחה <td>Expasy</td><td></td><td>, המסייעת בביאור נתוני גליקומיקה (https://web.expasy.org/glycomod/)</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>תוכנת גישה פתוחה, מסייעת בביאור נתוני גליקומיקה וציור קריקטורות גליקן</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>תוכנת גישה פתוחה, חילוץ m/z של יוני מבשר גליקן מנתונים ספקטרליים גולמיים</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 ומעלה</td><td>תוכנת גישה פתוחה לכימות יחסי של גליקנים</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 ומעלה</td><td>לעיון בנתוני LC-MS/MS גולמיים</td></tr></tbody></table>

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

תוצאות מייצגות של שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקס המיושמת על שקופית רקמת FFPE ממטופל הסובל מ- CRC בשלב II מובאות בסעיף זה.
כדי להשיג מספיק חומר מוצא חלבוני לפרוטוקול, תמציות חלבון משתי שקופיות (ערימות z) שולבו מאותו בלוק רקמת FFPE בעקבות פרוטוקול שפורסם ויושמה גישת תיוג TMT כדי להגביר את הרגישות של ניסוי הגליקופרוטאומיקה (ראה שלבים אופציונליים להלן)42.
ראשית, ניתוח של נתוני N-גליקומיקה מבוססי PGC-LC-MS/MS של רקמות FFPE CRC זיהה בסך הכ...

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

לכן אנו חוקרים פחמימות מורכבות, או גליקנים, במערכת החיסון המולדת והפרעות הקשורות למערכת החיסון, תוך התמקדות כיום באלח דם וסרטן. עבודתנו כוללת שיטות אנליטיות ומערכות גליקוביולוגיה, כולל שיטות גליקומיקה וגליקופרוטומיקה, לאפיון מפורט של הגליקופרוטאין האנושי. הגליקופרוטומיקה חוותה התקדמות אדירה בעשורים האחרונים, וההתקדמות כבר אינה מוגבלת על ידי המחסור בנתוני ספקטרומטריית מסה באיכות גבוהה.במקום זאת, האתגר הוא לפרש ולייצר ידע ביולוגי מהנתונים הספקטרליים. שיטת הגליקופרוטומיקה המונחית על ידי גליקומיקה מאפשרת למדעני גליקו לקבל תובנה עמוקה ומדויקת לגבי הגליקופרוטום והמחסומים הקשים עם מדדי בריאות האדם, גליקופרוטומיקה מסוגלת באופן ייחודי לייצר תובנות ספציפיות לאתר לגבי הגליקופרוטום. אבל שיעורי הגליקופפטידים נותרו גבוהים.כדי להתמודד עם בעיות השחזור הללו, שיטת הגליקופרוטומיקה שלנו מאפשרת פרופיל גליקופרוטומי מדויק על ידי הגדרת אילוצים במרחב החיפוש של הגליקן באמצעות סקר הגליקומיקס של אותה דגימה. בסופו של דבר, הוא מאפשר חיפושי גליקופפטידים מהירים ומדויקים יותר. שיטת הגליקופרוטומיקה מונחית הגליקומיקה שלנו מאפשרת מיפוי מקיף של ההטרוגניות והדינמיקה של מדדי הגליקופרוטום ממגוון דגימות אנושיות שונות.לכן שיטה זו יכולה לסייע לנו בהבנה טובה יותר של התקדמות המחלה ויכולה גם לסייע לנו למצוא סמנים ביולוגיים אבחנתיים חדשים למטרות טיפוליות נגד מגוון רחב של מחלות אנושיות. שיטת הגליקופרוטומיקה המונחית גליקומיקה מאפשרת לנו לפענח את המורכבות של הגליקופרוטום האנושי, אשר, בתורו, פותח שאלות ביולוגיות חדשות כמו כיצד מבני גליקן משפיעים על תפקוד החלבון, תקשורת התאים או תגובות חיסוניות. זה גם מעלה שאלות כיצד ומדוע דפוס הגליקוזילציה השתנה במחלות מסוימות.ותובנות אלה עשויות להוביל לתגליות וסמני אבחון חדשים וטיפולים מותאמים אישית במחלות מורכבות. כדי לשתק את החלבון המעניין על קרום PVDF, באמצעות ניקוב חור יחיד, חתוך את הממברנה על סמך מספר הדגימות שיש לאתר. הרטיבו את הממברנות שנכרתו במתנול, ואז העבירו אותן לצלחת שטוחה של 96 בארות.לאחר שהממברנות כמעט יבשות, יש למרוח 2.5 מיקרוליטר דגימות חלבון לכל נקודה. יבש את הממברנות באוויר בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות, או רצוי למשך הלילה, תוך הקפדה על זיהום. הוסף 100 מיקרוליטר של 1% PDP-40 במתנול לכל באר המכילה את הממברנות המנומרות.נענע את הצלחת בתמיסת PDP-40 בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, השלך את תמיסת ה-PDP-40. לאחר מכן, שטפו כל באר המכילה את כתמי החלבון החסומים עם 100 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד ונערו את הצלחת למשך חמש דקות.הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת PNGase F לכל באר. כדי למנוע התייבשות, הוסף מים לבארות הריקות שמסביב. אוטמים את הצלחת בזהירות עם סרט שקוף ודוגרים לפחות שמונה שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, סוניקציה של הצלחת למשך חמש דקות כדי לעזור לטיפות המתאדות בצידי הבארות להצטבר בתחתית. העבר את דגימות ה-N-גליקן המשוחררות לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר. שטפו היטב כל דגימה פעמיים עם 20 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד, שאפו ושילבו את כל הדגימות הנותרות לתוך הצינורות החדשים.לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטר של pH 5 אמוניום אצטט 100 מילי-מולרי ודגרו על הדגימות למשך שעה בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס. יבש את דגימות ה-N-glycan במערכת ריכוז ואקום. כדי להכין פחמן גרפיט נקבובי תוצרת בית, או מיצוי פאזה מוצקה PGC-C18, או מיקרו-עמודות SPE, השתמש במזרק כדי לחבר ולהעביר דיסקי C18 לקצות פיפטה של 10 מיקרוליטר.פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת שרף PGC תלויה ב-50% מתנול לתוך המיקרו-עמודים C18 SPE. הנח את המיקרו-עמודים בצינורות של 2 מיליליטר עם מתאמי מיקרו-צנטריפוגה. סובב את הצינורות ליצירת מיקרו-עמודים PGC-C18 SPE בגובה עמוד משוער של 0.5 סנטימטרים.לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית, או TFA, באצטוניטריל לתוך המיקרו-עמודות והצנטריפוגה ב-2000 G למשך 60 שניות כדי להקל על השלבים הניידים לעבור דרך המיקרו-עמודות. באופן דומה, שטפו ומרככו את המיקרו-עמודים שלוש פעמים באמצעות TFA מימי של 0.1%. החל את דגימות ה-N-glycan על כל עמודת מיקרו בנפחי טעינה של עד 40 מיקרוליטר.סובב את המיקרו-עמודה לאחר כל מהדורה, וחזור על הפעולה עד לטעינת הדגימה כולה. שוטפים כל עמוד מיקרו עם 20 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. העבר את המיקרו-עמודות לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר.כדי לנטרל את ה-N-גליקנים, הוסף 40 מיקרוליטר של 0.1% TFA ב-50% אצטוניטריל לכל מיקרו-עמודה. סובב את הצינורות ושלב את הפליטה מכל סיבוב. יבש את ה-N-גליקנים המומלחים במערכת ריכוזי ואקום.עיין בנתונים הגולמיים של LC-MS/MS שנוצרו באמצעות תוכנה מתאימה. אשר איכות נתונים גבוהה על ידי הערכת רוחב שיא LC צר, הפרדה יעילה של איזומרים N-גליקן, דיוק MS גבוה, רזולוציה ויחס אות לרעש, יחד עם יעילות פיצול CID MS/MS גבוהה. זיהוי ידני של N-גליקנים בדגימה על סמך מסת מבשר מונואיזוטופי, דפוסי פיצול CID MS/MS וזמני שימור PGC-LC יחסיים ומוחלטים.לכימות N-גליקן יחסי, צור רשימת מעבר המכילה את יחס המסה למטען המונואיזוטופי עבור כל איזומרי ה-N-גליקן שזוהו. קבע את השטח מתחת לערכי העקומה מכרומטוגרמות יונים שחולצו של כל יוני מבשר N-גליקן. להכנת מיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE, באמצעות מזרק, חבר והעביר דיסקי C8 לקצות פיפטה של 10 מיקרוליטר.הפקידו תרחיץ של שרף ZIC-HILIC התלוי במתנול לתוך המיקרו-עמודים C8-SPE. הנח את המיקרו-עמודים בצינורות של 2 מיליליטר עם מתאמי מיקרו-צנטריפוגה, וודא שהעמודים תלויים במרכז. סובב ליצירת מיקרו-עמודים C8-SPE HPLC בגובה משוער של סנטימטר אחד.הוסף 50 מיקרוליטר מתנול לתוך המיקרו-עמודות והצנטריפוגה ב-2000 G למשך 60 שניות, מה שמאפשר לשלבים הניידים לעבור דרך העמודה. באופן דומה, שטפו את עמודי המיקרו שלוש פעמים, כל אחד עם 50 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד ואחריהם 50 מיקרוליטר של 1% TFA ב-80% אצטוניטריל. השעו מחדש את תערובות הפפטידים המיובשות המיועדות להעשרת N-גליקופפטיד ב-50 מיקרוליטר של 1% TFA ב-80% אצטוניטריל, וערבבו היטב.הנח את המצב של מיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE בצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר עם מתאמי מיקרו-צנטריפוגה. מרחו את תערובות הפפטידים התלויות על כל מיקרו-עמודה וסובבו ב-2000 גרם למשך 60 שניות. אסוף את הזרימה דרך שברים והחל מחדש כל שבר על אותה מיקרו-עמודה ZIC-HILIC-C8-SPE.לאחר מכן הסירו את ה-N-גליקופפטיד בתוספת רציפה של 50 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 25 מילי-מולרי ו-50 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל. העבר את המיקרו-עמודות לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים בנפח 1.5 מיליליטר. כדי לחסל ברצף N-גליקופפטיד שנשמר, הוסף 50 מיקרוליטר של TFA מימי של 0.1% לתוך המיקרו-עמודות והצנטריפוגה ב-2000 G למשך 60 שניות.לאחר מכן הסירו את ה-N-גליקופפטיד בתוספת רציפה של 50 מיקרוליטר של 0.1% TFA מימי ואחריו 50 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 25 מילי-מולרי ו-50 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל. אסוף, שלב וייבש את ה-N-גליקופפטידים המועשרים והפפטיד הלא מותאם זורם דרך שברים במערכת ריכוז ואקום. ניתוח נתוני ה-N-גליקומיקה זיהה 76 איזומרים של N-גליקן ברקמות סרטן המעי הגס עם 70% גליקנים מורכבים/היברידיים, 20% אוליגומנוז ו-10% פאוצ'ימנוז.כל מבני ה-N-גליקן אושרו עם ראיות ספקטרליות, שכומתו באמצעות שטח מתחת לערכי העקומה מכרומטוגרמות יונים שחולצו.

glycomics-guided-glycoproteomics-facilitates-comprehensive-profiling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

ניתוחים מעמיקים של פרוטאומים של תאים סרטניים מקלים על זיהוי מטרות תרופות חדשות וסמנים ביולוגיים אבחוניים. אנו מתארים זרימת עבודה ניסויית לניתוח כמותי של פרוטאומים (פוספו-) בתת-אוכלוסיות של תאים סרטניים שמקורם בגידולים נוזליים ומוצקים. זה מושג על ידי שילוב של אסטרטגיות העשרה תאיות עם ספקטרומטריית מסה כמותית מבוססת Super-SILAC.

Mass כמותי spectrometric פרופיל של Proteomes סרטן התאים נגזרים מנוזלים וגידולים מוצקים

מאמר זה מציג צורה משופרת של טכניקת גליקומיקה חדשה מלמטה למעלה שנועדה לנתח את פרופיל ההרכב המאוגד של גליקנים בנוזלים ביולוגיים לא מפוצלים באמצעות פירוק כימי של גליקנים לחד-סוכרים ספציפיים לקישור המרכיב אותם לזיהוי על ידי GC-MS. יישומים פוטנציאליים כוללים גילוי מוקדם של סרטן והפרעות אחרות הנוגעות לגליקן.

ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics

מאמר זה מתאר מתודולוגיה להכין דגימות רקמות וכלי דם לצורך ניתוח MS המאפשרת (1) ניתוח של הרכב החלבון ECM, (2) זיהוי של אתרי glycosylation, ו (3) אפיון ההלחנה של צורות glycan. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת, עם שינויים קלים, כדי המחקר של ECM ברקמות אחרות.

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

פרוטוקול זה ממחיש כיצד לחקור, להשוות ולפרש גלייקום חלבון אנושי באמצעות משאבים מקוונים.

משאבי ביואינפורמטיקה לחקר אינטראקציות חלבון בתיווך גליקן

פרוטוקול זה מפרט מתודולוגיה לזיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון בקטעי רקמה משובצים פרפין קבועים בפורמלין.

קרטוגרפיה מולקולרית דו-מודאלית: שילוב זיהוי mRNA מרובה עם ציטומטריית מסה של הדמיית חלבון

פרוטוקול זה הצליח להכין מספיק רקמות ניאווסקולריות איכותיות מדגימות גליומה באמצעות מיקרודיסקציה באמצעות לכידת לייזר לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה גידולית, תוך התגברות על מגבלות מחקרים שמסורתית מתמקדים בעיקר בגורמים אנגיוגניים וסיפק פרופיל פרוטאומיקה רחב היקף של אנגיוגנזה של גליומה.

הכנת רקמות ניאווסקולריות מרקמות גליומה אנושיות לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה של גידול

למד שיטת גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס לניתוח מקיף של הגליקופרוטאום בסביבות גידול סרטניות מורכבות. השיטה מספקת תובנות מדויקות לחקר גליקוביולוגיה של סרטן וזיהוי ביומרקרים.

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות

גלה סרטונים נוספים