גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות

לכן אנו חוקרים פחמימות מורכבות, או גליקנים, במערכת החיסון המולדת והפרעות הקשורות למערכת החיסון, תוך התמקדות כיום באלח דם וסרטן. עבודתנו כוללת שיטות אנליטיות ומערכות גליקוביולוגיה, כולל שיטות גליקומיקה וגליקופרוטומיקה, לאפיון מפורט של הגליקופרוטאין האנושי. הגליקופרוטומיקה חוותה התקדמות אדירה בעשורים האחרונים, וההתקדמות כבר אינה מוגבלת על ידי המחסור בנתוני ספקטרומטריית מסה באיכות גבוהה.

במקום זאת, האתגר הוא לפרש ולייצר ידע ביולוגי מהנתונים הספקטרליים. שיטת הגליקופרוטומיקה המונחית על ידי גליקומיקה מאפשרת למדעני גליקו לקבל תובנה עמוקה ומדויקת לגבי הגליקופרוטום והמחסומים הקשים עם מדדי בריאות האדם, גליקופרוטומיקה מסוגלת באופן ייחודי לייצר תובנות ספציפיות לאתר לגבי הגליקופרוטום. אבל שיעורי הגליקופפטידים נותרו גבוהים.

כדי להתמודד עם בעיות השחזור הללו, שיטת הגליקופרוטומיקה שלנו מאפשרת פרופיל גליקופרוטומי מדויק על ידי הגדרת אילוצים במרחב החיפוש של הגליקן באמצעות סקר הגליקומיקס של אותה דגימה. בסופו של דבר, הוא מאפשר חיפושי גליקופפטידים מהירים ומדויקים יותר. שיטת הגליקופרוטומיקה מונחית הגליקומיקה שלנו מאפשרת מיפוי מקיף של ההטרוגניות והדינמיקה של מדדי הגליקופרוטום ממגוון דגימות אנושיות שונות.

לכן שיטה זו יכולה לסייע לנו בהבנה טובה יותר של התקדמות המחלה ויכולה גם לסייע לנו למצוא סמנים ביולוגיים אבחנתיים חדשים למטרות טיפוליות נגד מגוון רחב של מחלות אנושיות. שיטת הגליקופרוטומיקה המונחית גליקומיקה מאפשרת לנו לפענח את המורכבות של הגליקופרוטום האנושי, אשר, בתורו, פותח שאלות ביולוגיות חדשות כמו כיצד מבני גליקן משפיעים על תפקוד החלבון, תקשורת התאים או תגובות חיסוניות. זה גם מעלה שאלות כיצד ומדוע דפוס הגליקוזילציה השתנה במחלות מסוימות.

ותובנות אלה עשויות להוביל לתגליות וסמני אבחון חדשים וטיפולים מותאמים אישית במחלות מורכבות. כדי לשתק את החלבון המעניין על קרום PVDF, באמצעות ניקוב חור יחיד, חתוך את הממברנה על סמך מספר הדגימות שיש לאתר. הרטיבו את הממברנות שנכרתו במתנול, ואז העבירו אותן לצלחת שטוחה של 96 בארות.

לאחר שהממברנות כמעט יבשות, יש למרוח 2.5 מיקרוליטר דגימות חלבון לכל נקודה. יבש את הממברנות באוויר בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות, או רצוי למשך הלילה, תוך הקפדה על זיהום. הוסף 100 מיקרוליטר של 1% PDP-40 במתנול לכל באר המכילה את הממברנות המנומרות.

נענע את הצלחת בתמיסת PDP-40 בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, השלך את תמיסת ה-PDP-40. לאחר מכן, שטפו כל באר המכילה את כתמי החלבון החסומים עם 100 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד ונערו את הצלחת למשך חמש דקות.

הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת PNGase F לכל באר. כדי למנוע התייבשות, הוסף מים לבארות הריקות שמסביב. אוטמים את הצלחת בזהירות עם סרט שקוף ודוגרים לפחות שמונה שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, סוניקציה של הצלחת למשך חמש דקות כדי לעזור לטיפות המתאדות בצידי הבארות להצטבר בתחתית. העבר את דגימות ה-N-גליקן המשוחררות לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר. שטפו היטב כל דגימה פעמיים עם 20 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד, שאפו ושילבו את כל הדגימות הנותרות לתוך הצינורות החדשים.

לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטר של pH 5 אמוניום אצטט 100 מילי-מולרי ודגרו על הדגימות למשך שעה בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס. יבש את דגימות ה-N-glycan במערכת ריכוז ואקום. כדי להכין פחמן גרפיט נקבובי תוצרת בית, או מיצוי פאזה מוצקה PGC-C18, או מיקרו-עמודות SPE, השתמש במזרק כדי לחבר ולהעביר דיסקי C18 לקצות פיפטה של 10 מיקרוליטר.

פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת שרף PGC תלויה ב-50% מתנול לתוך המיקרו-עמודים C18 SPE. הנח את המיקרו-עמודים בצינורות של 2 מיליליטר עם מתאמי מיקרו-צנטריפוגה. סובב את הצינורות ליצירת מיקרו-עמודים PGC-C18 SPE בגובה עמוד משוער של 0.5 סנטימטרים.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית, או TFA, באצטוניטריל לתוך המיקרו-עמודות והצנטריפוגה ב-2000 G למשך 60 שניות כדי להקל על השלבים הניידים לעבור דרך המיקרו-עמודות. באופן דומה, שטפו ומרככו את המיקרו-עמודים שלוש פעמים באמצעות TFA מימי של 0.1%. החל את דגימות ה-N-glycan על כל עמודת מיקרו בנפחי טעינה של עד 40 מיקרוליטר.

סובב את המיקרו-עמודה לאחר כל מהדורה, וחזור על הפעולה עד לטעינת הדגימה כולה. שוטפים כל עמוד מיקרו עם 20 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. העבר את המיקרו-עמודות לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר.

כדי לנטרל את ה-N-גליקנים, הוסף 40 מיקרוליטר של 0.1% TFA ב-50% אצטוניטריל לכל מיקרו-עמודה. סובב את הצינורות ושלב את הפליטה מכל סיבוב. יבש את ה-N-גליקנים המומלחים במערכת ריכוזי ואקום.

עיין בנתונים הגולמיים של LC-MS/MS שנוצרו באמצעות תוכנה מתאימה. אשר איכות נתונים גבוהה על ידי הערכת רוחב שיא LC צר, הפרדה יעילה של איזומרים N-גליקן, דיוק MS גבוה, רזולוציה ויחס אות לרעש, יחד עם יעילות פיצול CID MS/MS גבוהה. זיהוי ידני של N-גליקנים בדגימה על סמך מסת מבשר מונואיזוטופי, דפוסי פיצול CID MS/MS וזמני שימור PGC-LC יחסיים ומוחלטים.

לכימות N-גליקן יחסי, צור רשימת מעבר המכילה את יחס המסה למטען המונואיזוטופי עבור כל איזומרי ה-N-גליקן שזוהו. קבע את השטח מתחת לערכי העקומה מכרומטוגרמות יונים שחולצו של כל יוני מבשר N-גליקן. להכנת מיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE, באמצעות מזרק, חבר והעביר דיסקי C8 לקצות פיפטה של 10 מיקרוליטר.

הפקידו תרחיץ של שרף ZIC-HILIC התלוי במתנול לתוך המיקרו-עמודים C8-SPE. הנח את המיקרו-עמודים בצינורות של 2 מיליליטר עם מתאמי מיקרו-צנטריפוגה, וודא שהעמודים תלויים במרכז. סובב ליצירת מיקרו-עמודים C8-SPE HPLC בגובה משוער של סנטימטר אחד.

הוסף 50 מיקרוליטר מתנול לתוך המיקרו-עמודות והצנטריפוגה ב-2000 G למשך 60 שניות, מה שמאפשר לשלבים הניידים לעבור דרך העמודה. באופן דומה, שטפו את עמודי המיקרו שלוש פעמים, כל אחד עם 50 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד ואחריהם 50 מיקרוליטר של 1% TFA ב-80% אצטוניטריל. השעו מחדש את תערובות הפפטידים המיובשות המיועדות להעשרת N-גליקופפטיד ב-50 מיקרוליטר של 1% TFA ב-80% אצטוניטריל, וערבבו היטב.

הנח את המצב של מיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE בצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר עם מתאמי מיקרו-צנטריפוגה. מרחו את תערובות הפפטידים התלויות על כל מיקרו-עמודה וסובבו ב-2000 גרם למשך 60 שניות. אסוף את הזרימה דרך שברים והחל מחדש כל שבר על אותה מיקרו-עמודה ZIC-HILIC-C8-SPE.

לאחר מכן הסירו את ה-N-גליקופפטיד בתוספת רציפה של 50 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 25 מילי-מולרי ו-50 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל. העבר את המיקרו-עמודות לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים בנפח 1.5 מיליליטר. כדי לחסל ברצף N-גליקופפטיד שנשמר, הוסף 50 מיקרוליטר של TFA מימי של 0.1% לתוך המיקרו-עמודות והצנטריפוגה ב-2000 G למשך 60 שניות.

לאחר מכן הסירו את ה-N-גליקופפטיד בתוספת רציפה של 50 מיקרוליטר של 0.1% TFA מימי ואחריו 50 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 25 מילי-מולרי ו-50 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל. אסוף, שלב וייבש את ה-N-גליקופפטידים המועשרים והפפטיד הלא מותאם זורם דרך שברים במערכת ריכוז ואקום. ניתוח נתוני ה-N-גליקומיקה זיהה 76 איזומרים של N-גליקן ברקמות סרטן המעי הגס עם 70% גליקנים מורכבים/היברידיים, 20% אוליגומנוז ו-10% פאוצ'ימנוז.

כל מבני ה-N-גליקן אושרו עם ראיות ספקטרליות, שכומתו באמצעות שטח מתחת לערכי העקומה מכרומטוגרמות יונים שחולצו.