הדמיה תלת מימדית של פריציטים וסקולריים ברשתית בעכברים על ידי צביעה חיסונית

היקף המחקר הוא לחקור את המורפולוגיה וההתפלגות המרחבית של טפילים בכלי הדם ברשתית באמצעות טכניקות הדמיה מתקדמות. על מנת לספק מבט מפורט להדגמת המאפיינים המורפולוגיים של טפילים, המחקר תיאר גישה חדשה המשלבת הזרקה רטרואורביטלית של חומר פלואורסצנטי, צביעה אימונו-פלואורסצנטית וטיפול בניקוי רקמות כדי לקדם את המחקר בתחום שלנו.

בהשוואה למצב הניקוי המקדים של רקמת הרשתית של העכבר, אותות הרקע של כלי דם וטפילים המסומנים בלקטין עגבניות פלואורסצנטי ו-PDGFR-beta מופחתים משמעותית לאחר ניקוי הרקמות, ומאפשרים התבוננות מדויקת יותר בקשר המרחבי שלהם.

התוצאות שלנו מצביעות על כך שטכניקות אלה תואמות מאוד להדגמת הטפילים בכלי הדם של הרשתית בכל רשתית ההר. השילוב של טכניקות היסטולוגיות אלה הוא גישה יעילה להמחשת המאפיינים המורפולוגיים של טפילים בפירוט מנקודת מבט תלת מימדית.

[מדריך] כדי להתחיל, הניחו את העכבר המורדם בשכיבה הרוחבית הימנית כשראשו פונה שמאלה. לחץ בעדינות על שתי אצבעות על האזור הפריאורביטלי כדי לחשוף את עינו השמאלית של העכבר. בעזרת מזרק של מיליליטר המצויד במחט בגודל 27, חודרים בעדינות כשניים עד שלושה מילימטרים לתוך הסינוס הוורידי המסלולי, ומוודאים שהשיפוע של המחט פונה קדימה בזווית של 45 מעלות. הזרקו 0.1 מיליליטר של לקטין עגבניות פלואורסצנטי לסינוס הוורידי המסלולי. לאחר חמש דקות של הזרקה רטרואורביטלית, המתת חסד של העכבר והשתמש במספריים כירורגיים כדי לפתוח את חלל בית החזה. הכנס מחט בגודל 24 שני מילימטרים לחדר הלב השמאלי דרך קודקוד החדר השמאלי. בצע זלוף בקצב של שלושה מיליליטר לדקה עם 20 מיליליטר של 0.9% מלח פיזיולוגי, ואחריו 20 מיליליטר של 4% מלח פיזיולוגי. הזרקו 0.1 מיליליטר של 0.9% פורמלדהיד במאגר פוספט מולארי של 0.1. לאחר מכן, הניחו את העכבר שהוקרב על צדו והסירו את העור המכסה את העיניים במספריים. גרעין את העיניים עם מספריים ומלקחיים. חתכו את עצב הראייה והרקמות שמסביב והרימו את העין. העבירו את העין לצלחת של 12 בארות לקיבוע פורמלדהיד 4% במאגר פוספט 0.1 מולרי למשך שעתיים. לאחר הקיבוע, הגן על העין בהקפאה ב-25% סוכרוז במאגר פוספט מולרי של 0.1 בארבע מעלות צלזיוס עד שהיא שוקעת לתחתית התמיסה. בעזרת פיפטת פסטור מפלסטיק, העבירו את העין לצלחת פטרי המכילה 0.1 מולארי פוספט. חודרים את קצה הקרנית במספריים חדים, חותכים סביב הקרנית והקשתית וזורקים אותם. בעזרת מלקחיים, הסר את העדשה וההומור הזגוגי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי למשוך את הרשתית בצורת ממרכז העין. שוטפים את הרשתית עם מאגר פוספט מולארי 0.1 בצלחת פטרי נקייה. לאחר בידוד רשתית העכבר בצורת, דגרו אותה באינקובטור של 20 שעות עם תמיסת טריטון X-100 2% במאגר פוספט מולארי של 0.1 למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הרשתית לתמיסת החסימה וסובבו ב-72 סל"ד על השייקר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הנח את הרשתית לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את הנוגדנים העיקריים של בטא נגד PDGFR עזים במאגר דילול. סובב את הצינור על השייקר למשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר יומיים יש לשטוף את הרשתית פעמיים עם מאגר כביסה בטמפרטורת החדר. מניחים את הרשתית במאגר הכביסה ומעבירים אותה לשייקר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הרשתית לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר נוגדן משני של חמור נגד עזים 488 ו-0.2 ננוגרם למיליליטר כתם גרעיני פלואורסצנטי DAPI. סובב את הצינור על השייקר ב-72 סל"ד למשך חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס. שוטפים את הרשתית בצלחת של שש בארות עם מאגר כביסה למשך שעה פעמיים בטמפרטורת החדר. דגרו את הרשתית במאגר הכביסה על השייקר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הרשתית למגיב ניקוי הרקמות וסובבו אותה בעדינות על השייקר ב-60 סל"ד למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר ניקוי הרקמות, שטפו את הרשתית עם מאגר פוספט מולרי 0.1 בצלחת פטרי נקייה. בעזרת מספריים קפיציים, בצע ארבעה חתכים רדיאליים המגיעים לכ- 2/3 מרדיוס הרשתית ליצירת צורת עלי כותרת. משטחים את הרשתית ומרכיבים אותה על שקופית מיקרוסקופ כשהחלק הפנימי של הרשתית פונה כלפי מעלה. השתמש בפיסת נייר סופגת קטנה כדי להסיר עודפי מאגר פוספט. הקיפו את הרשתית המותקנת בעזרת מרווח. מלאו את הפער במגיב לניקוי רקמות טריות והניחו מעליה תלוש כיסוי. סרוק את תצוגות המונטאז' של הרשתית המסומנת באמצעות סורק פרוסות רקמה פנורמי. צלם את התמונות בהגדלה גבוהה יותר באמצעות מערכת הדמיה המצוידת בעדשת 2X ו-10X עם צמצמים מספריים של 0.40 ו-0.95, בהתאמה. צלם תמונות ערימה של 50Z מהרשתית המסומנת בשתי מסגרות מיקרומטר. לחץ ברצף על Set Start Focal Plane, Set End Focal Plane, Set Step Size, Choose Depth Pattern, Image Capture ו-Z-Series כדי לשלב את כל התמונות לתמונה אחת במיקוד באמצעות מצב הקרנה וטופוגרפיה. לאחר מכן, צלמו תמונות באמצעות הקרינה הירוקה ב-499 ו-519 ננומטר, הקרינה האדומה ב-591 ו-618 ננומטר והפלואורסצנציה הכחולה ב-401 ו-421 ננומטר. בחר ברצף הוסף משטחים חדשים, בחר הגדרות עוצמת קול, בחר ערוץ מקור, התאם את התצוגה, התאם את זווית פני השטח וצילום בזק כדי לייבא את התמונות הקונפקוליות של Z-Stack לתוכנת ניתוח ולבנות מחדש את התמונות בתבנית התלת מימדית. שקיפות הרקמות של כל רשתית ההר גדלה לאחר טיפול ניקוי הרקמות בהשוואה לרשתית ללא ניקוי רקמות. כלי הדם ברשתית המסומנים בלקטין עגבניות וטפילי רשתית המסומנים ב-PDGFR-β נראו לפני ואחרי ניקוי הרקמות, אך רעשי הרקע הופחתו לאחר פינוי הרקמות. טפילי רשתית נצפו לאורך עץ כלי הדם, והראו התפלגות הדרגתית מהאזורים המרכזיים וההיקפיים של הרשתית. תמונות ה-Z-Stack התלת-ממדיות מהרשתית הנקייה הראו טפילים עטופים היטב סביב כלי רשתית בקטרים שונים עם צביעת PDGFR-β חזקה יותר בנימים.