Name: נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: חקור הנדסה גנטית של תאי THP-1 באמצעות CRISPR-Cas9 ואלקטרופורציה לחקר עמידות מאקרופאגים להדבקת HIV. הפרוטוקול כולל בידוד שיבוטי תא בודד וניתוח פנוטיפי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+by+normal+human+monocytes%3A+inter-subject+variation+and+relationship+to+an+IL-1+receptor+antagonist+%28IL-lRa%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism.</a> Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).</li>
<li>Bol, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+variation+in+in+vitro+HIV-1+susceptibility+of+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 390 (2), 205-211 (2009).</li>
<li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).</li>
<li>O'Neill, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+bulk+RNA-sequencing+reveal+differences+in+monocyte+susceptibility+to+Influenza+A+virus+infection+between+Africans+and+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans.</a> Front Immunol. 12, 768189(2021).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparability+study+of+monocyte-derived+dendritic+cells%2C+primary+monocytes%2C+and+THP1+cells+for+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses.</a> J Immunol Methods. 498, 113147(2021).</li>
<li>Inagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-g-induced+apoptosis+and+activation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages.</a> Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).</li>
<li>Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+activities+of+stevioside+and+its+metabolite+steviol+on+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells.</a> J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).</li>
<li>Chanput, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucans+are+involved+in+immune-modulation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages.</a> Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP3+inhibits+type+I+interferon+signaling+by+deubiquitinating+RIG-I-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors.</a> Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+suppresses+innate+immune+responses+to+viral+infections+and+inflammatory+stimuli+by+inhibiting+the+NF-%CE%BAB+and+interferon+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).</li>
<li>Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+anchored+interaction+landscape+of+THP-1+macrophages+captures+early+immune+response+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes.</a> Cell Immunol. 355, 104148(2020).</li>
<li>Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anp+and+BNP+exert+anti-inflammatory+action+via+npr-1%2Fcgmp+axis+by+interfering+with+canonical%2C+non-canonical%2C+and+alternative+routes+of+inflammasome+activation+in+human+THP1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Martinat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+SAMHD1+at+Lysine+595+is+required+for+HIV-1+restriction+in+non-cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).</li>
<li>Rensen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+and+reverse+transcription+of+HIV-1+genomes+in+nuclear+niches+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages.</a> EMBO J. 40 (1), e105247(2021).</li>
<li>Ikeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOBEC3+degradation+is+the+primary+function+of+HIV-1+Vif+determining+virion+infectivity+in+the+myeloid+cell+line+THP-1%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1.</a> mBio. 14 (4), e0078223(2023).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Kurosaki, T., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay+in+humans+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance.</a> J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).</li>
<li>Tuladhar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-based+mutagenesis+frequently+provokes+on-target+mRNA+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation.</a> Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).</li>
<li>Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+factors+that+dictate+if+terminating+ribosomes+cause+or+counteract+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+transfection+efficiency+in+THP-1+suspension+cells+without+PMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment.</a> Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).</li>
<li>Ji, W., Zhang, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+using+lentivirus+to+establish+THP-1+suspension+cell+lines+for+immunostaining+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).</li>
<li>Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. 
 <a target="_blank" href="https://www.synthego.com/help/citing-ice">https://www.synthego.com/help/citing-ice</a> (2019).</li>
<li>Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+protein+coding+region+integrity+in+cDNA+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects.</a> Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).</li>
<li>Pedersen, A. G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+prediction+of+translation+initiation+sites+in+eukaryotes%3A+Perspectives+for+EST+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Int+Conf+Intell+Syst+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis.</a> Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).</li>
<li>Laguette, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+the+dendritic-+and+myeloid-cell-specific+HIV-1+restriction+factor+counteracted+by+Vpx%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx.</a> Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).</li>
<li>Hrecka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+relieves+inhibition+of+HIV-1+infection+of+macrophages+mediated+by+the+SAMHD1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein.</a> Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).</li>
<li>Seki, A., Rutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+RNP+transfection+for+highly+efficient+CRI+SPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.</a> J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mutant+renal+cell+lines+using+CRISPR+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies.</a> Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 888(2018).</li>
<li>Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illegitimate+translation+causes+unexpected+gene+expression+from+on-target+out-of-frame+alleles+created+by+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9.</a> Sci Rep. 6, 39608(2016).</li>
<li>Bowling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+alternate+start+site+allows+N-terminal+nonsense+variants+to+escape+NMD+and+results+in+functional+recovery+by+readthrough+and+modulator+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination.</a> J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).</li>
<li>Inácios, Â, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+mutations+in+close+proximity+to+the+initiation+codon+fail+to+trigger+full+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inversions+and+duplications+of+mammalian+regulatory+DNA+elements+and+gene+clusters+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9.</a> J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162 (4), 900-910 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.2 ומיקרו; m מסנן מזרק</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td>_</td></tr><tr><td>0.4% טריפן כחול</td><td>בקמן קולטר</td><td>383200</td><td>_</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>_</td></tr><tr><td>24 בארות צלחת</td><td>קורנינג</td><td>353047</td><td>_</td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA טעינת צבע</td><td>תרמו מדעי</td><td>R1161</td><td>_</td></tr><tr><td>75 ס"מ&sup2; בקבוק תרבות כובע מאוורר</td><td>קורנינג</td><td>353136</td><td>_</td></tr><tr><td>8 רצועות צינורות PCR עם כובעים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM12230</td><td>_</td></tr><tr><td>96 בארות צלחות</td><td>קורנינג</td> תחתון שטוח <td>353072</td><td>_</td></tr><tr>96 בארות <td>קורנינג</td> <td>תחתון עגול</td><td>353077</td><td>_</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Euromedex</td><td>D5</td><td>_</td></tr><tr><td>ATGpr</td><td>_</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>https://atgpr.dbcls.jp/ מערכת הדמיה ChemiDoc</td><td>BIO-RAD</td><td>12003153</td><td>_</td></tr><tr><td>Counting slide</td><td>NanoEntek</td><td>DHC-N04</td><td>_</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>_</td><td>_</td><td>http://crispor.gi.ucsc.edu/</td></tr> <tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>_</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>EMBL-EBI</td><td>_</td><td>https://www.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>בקר עוברי Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Life Sciences</td><td>v10.10</td><td>_</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA</td><td>Ladder Thermo scientific</td><td>SM0323</td><td>_</td></tr><tr><td>Genome Data Viewer</td><td>NCBI</td><td>_</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/</td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 9.3.1</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerases</td><td>כלי ניתוח Agilent</td><td>600679</td><td>_</td></tr><tr><td>ICE CRISPR</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis</td></tr><tr><td>Image Lab Touch</td><td>BIO-RAD_</td><td></td><td>Version 2.4.0.03</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>כלול בערכת ניאון T7EI M0302S</td></tr><tr><td>, 10 ומיקרו; L</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025K</td><td>ערכת אלקטרופורציה המכילה טיפים, צינורות, מאגר R ו-E</td></tr><tr><td>מערכת העברת ניאון</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>_</td></tr><tr><td>NetStart 1.0</td><td>_</td><td>_</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/</td></tr> פריימר <tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td></td><td></td><td></td></tr>'<tr><td>__PCR (EGFP)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTCTTCT</td></tr><tr><td>פריימר PCR (SAMHD1)</td> <td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev: GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>_</td></tr><tr><td>PFA</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15714</td><td>_</td></tr><tr><td>PMA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8139</td><td>_</td></tr><tr><td>PrimerQuest</td><td>IDT</td><td>_</td><td>https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest</td></tr><tr><td>QIAערכת טיהור PCR מהירה</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>_</td></tr><tr><td>פתרון מיצוי DNA של QuickExtract</td><td>טכנולוגיות Biosearch</td><td>QE09050</td><td>_</td></tr><tr><td>RPMI 1640, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td>_</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 7</td></tr><tr><td>SpCas9 2NLS Nuclease</td><td>Synthego</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>_SYBR כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>_</td></tr><tr><td>sgRNA סינתטי (EGFP)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG</td></tr><tr><td>sgRNA סינתטי (SAMHD1)</td> <td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU</td></tr><tr><td>מזרק Plastipak Luer Lock</td><td>BD</td><td>301229</td><td>_</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td>_</td></tr><tr><td>T7 endonuclease I</td><td>חדש אנגליה Biolabs</td><td>M0302S</td><td>_</td></tr><tr><td>TAE מאגר UltraPure, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15558026</td><td>400 מ"מ Tris-Acetate, 10 מ"מ תאי EDTA</td></tr><tr><td>THP-1 ATCC</td><td>TIB-202</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td>_</td></tr><tr><td>ZE5 מנתח תאים</td><td>BIO-RAD</td><td>12014135</td><td>_</td></tr></tbody></table>

נוקאאוט גנים בתיווך crispr-cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי thp-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

קו תאים THP-1 נוצר ביציבות המבטא את חלבון מדווח GFP (THP-1_GFP) (איור 2A) ושימש ככלי להקמת פרוטוקול למהדורת גנים יעילה בתיווך CRISPR-Cas9. למטרה זו, 3 sgRNA המכוונים לגן EGFP תוכננו עם כלי האינטרנט CRISPOR29 (איור 2B), אשר הורכבו בו זמנית עם Cas9 ביחס מולארי של 9:1 ליצירת RNPs לפני העברתם לתאים על ידי אלקטרופורציה באמצעות הגדרות שונות. לאחר מכן, תאים גודלו במדיום RPMI המכיל 20% FBS בלבד (איור 2C, פאנ...

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

electroporation-based-crispr-cas9-mediated-gene-knockout-thp-1-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה, אנו מדגימים עריכת גנום מבוססת CRISPR-Cas9 All-in-One בתאים בתרבית, כאשר Cas9 ו-sgRNA מסופקים כמבנה פלסמיד יחיד לתאים. מערכת CRISPR-Cas9 והגן הרצוי להחדרה הוכנסו לתאים באמצעות טכניקת אלקטרופורציה כדי להקל על עריכת גנים מוצלחת.

All-in-One CRISPR Genome Editing: שיטה להומולוגיה של גנים מבוססי תיקון בתאים בתרבית באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע עריכת גנים בתאי T אנושיים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. תערובת של תאי T ראשוניים CD4+ ו- CD8+ משולבת עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9, המכוון לגנים ספציפיים לנוקאאוט. לאחר ההתחשמלות, ה-sgRNA מנחה את Cas9 לרצף הדנ"א של המטרה, ויוצר חתכים מדויקים. חתכים אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנון חיבור הקצה הלא הומולוגי של התא, המוביל לנוקאאוט גנטי.

טכניקת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי T

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שינוי גנטי ראשי או מורחב האנושי הטבעיים (NK) תאים הרוצח באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). באמצעות פרוטוקול זה, אנו להפיק תאי NK אדם חסר צורה של קולטן גורם גדילה – b 2 (TGFBR2), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף לייצור ושימוש באורגנואידים של גליובלסטומה מהונדסים במעבדה (LEGO) כדי לחקור תלות גנוטיפ-פנוטיפ ולסנן תרופות פוטנציאליות לטיפול בגליובלסטומה.

תרבית אורגנואידים של גליובלסטומה מהונדסת במעבדה וסינון תרופות

פרוטוקול מפורט מסופק לשימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג דפיקה ממוקדת יעילה ביותר של מבנים גדולים ומולטי-ציסטרוניים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מסלול תיקון ה-DNA בתיווך הומולוגיה (HMEJ). תאי T המהונדסים עם פרוטוקול זה הניתן להתאמה ל-cGMP שומרים על התרחבות תאים מצוינת, ציטוטוקסיות וייצור ציטוקינים.

הנדסה לא ויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות אינטגרציה ממוקדת בתיווך הומולוגיה של תבניות DNA גדולות

חקור הנדסה גנטית של תאי THP-1 באמצעות CRISPR-Cas9 ואלקטרופורציה לחקר עמידות מאקרופאגים להדבקת HIV. הפרוטוקול כולל בידוד שיבוטי תא בודד וניתוח פנוטיפי.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

גלה סרטונים נוספים