נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

פעילות המחקר שלי מתמקדת בהבנת המנגנונים שהופכים את המקרופאגים לעמידים בפני זיהום על ידי HIV, הנגיף האחראי למגפת האיידס. בפרט, אנו מתמקדים בפעילות של אנזים שנקרא HT-1 כלשהו שמפרק את ה-NTPs, אבני הבניין של הגנום הנגיפי. אבל לאנזים הזה יש גם פעילויות אחרות שאנו מנסים להבהיר.

הקמנו פרוטוקול להנדסה גנטית של תאי THP1. תאים אלה הם תחליף מבוסס היטב למקרופאגים אנושיים למחקר. למשל, שכפול של HIV-1.

קשה להעביר תאים אלה כדי לתפעל את תכולת החלבון שלהם. לכן, אנו קובעים שיטות למניפולציה של הגנום שלהם באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. מתכנון RNA SG ועד לאימות אוכלוסיות רב-שבטיות וחד-שבטיות.

הפרוטוקול שלנו שואף להשיג עריכה ביעילות גבוהה של גן מעניין בתאי THP1 שיעברו אלקטרופוטציה עם קומפלקסים ריבונוקלאופרוטאין שהורכבו מראש המיוצרים על ידי RNA אנרגיית נוקלאז Cas9. בגישה זו, פעילות Cas9 מוגבלת בזמן. זה מקטין את האפשרות ליצור השפעות מטרה שמתעוררות לעתים קרובות כאשר משתמשים בווקטורי לנטי.

ובמקרה זה, אכן ביטוי Cas9 מאריך את הזמן ולכן הוא יכול להזיק לתא. כדי להתחיל, מלא כל באר של צלחת תרבית 24 בארות ב -500 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640 ללא אנטיביוטיקה ובתוספת 20% FBS מושבת ומסונן. מניחים את הצלחת בחממה לחה למשך הלילה.

כדי להחזיר לחות את המדריך היחיד היבש או ה-sgRNAs לריכוז סופי של 100 מיקרומולר, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר TE לכל ננו-מול אחד של sgRNA. מערבל את התמיסה למשך 30 שניות ודוגר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להבטיח החזרת נוזלים מלאה. למחרת, כדי להכין את תמיסת ה-sgRNA העובדת של 30 מיקרו-מולאר, תחילה הומוגניזציה קצרה של תמיסת ה-sgRNA של 100 מיקרו-מולרית עם פיפטה, ולאחר מכן דלל את הגבעול במים נטולי נוקלאז.

מערבל את התמיסה למשך 30 שניות ודוגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. יש לדלל מיקרוליטר אחד מכל אחד מהשלושה, 30 פתרונות העבודה של sgRNA מיקרו-מולרי ו-0.5 מיקרוליטר של תמיסת Cas9 מיקרו-מולרית ב-3.5 מיקרו-ליטר של מאגר השעיה R, כדי להרכיב את הריבונוקלאופרוטאינים של Cas9 sgRNA מוסיפים יחס של 1 עד 9 מולאר. מערבולת קצרה ודוגרת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

להכנת בקרה לא ערוכה הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסת Cas9 של 20 מיקרומולרית ל-6.5 מיקרוליטר של מאגר השעיה R.Vortex לזמן קצר ודגירה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הוסף חמישה מיקרוליטר של מאגר השעיה R לדגימות כדי להשיג נפח סופי של 12 מיקרוליטר לכל מצב אלקטרופורציה. כדי להכין תאי THP-1 לאחר ספירת תאים, אספו נפח שווה ערך ל-0.2 כפול 10 בחזקת שישה מתאי THP-1 וצנטריפוגה אותם ב-336G למשך חמש דקות ב-20 מעלות צלזיוס, שאפו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS. צנטריפוגה שוב ולהשעות מחדש את כדור התא ב-12 מיקרוליטר של תמיסת ריבונוקלאופרוטאין.

כדי להגדיר את מערכת האלקטרופורציה, הנח את תחנת הפיפטה מתחת לארון בטיחות ביולוגית ומקם צינור אלקטרופורציה בתוך הארון, הוסף שלושה מיליליטר של חיץ E מערכת האלקטרופורציה לצינור האלקטרופורציה. הפעל את מכשיר האלקטרופורציה והשתמש במסך המגע כדי להגדיר את פרמטרי האלקטרופורציה, המתח ל-1, 500 וולט. משך עד 10 אלפיות השנייה.

ומספר לשלוש. ציידו את פיפטת האלקטרופורציה בקצה ושאבו 10 מיקרוליטר מתמיסת הריבונוקלאופרוטאין THP-1. הכנס את הפיפטה לתוך צינור האלקטרופורציה ולחץ על התחל במסך מכשיר האלקטרופורציה.

המתן עד שההודעה תושלם והסר את הפיפטה מהצינור. העבירו את תאי ה-THP-1 לבאר של צלחת התרבית 24 בארות שחוממה מראש והומוגניזציה עדינה של הדגימה. החזירו את הצלחת לאינקובטור הלח ואפשרו לתאים לנוח ללא הפרעה למשך 72 שעות.

לאחר אלקטרופורציה וספירת תאים, משוך נפח שווה ערך ל-0.1 כפול 10 בחזקת שישה תאי THP-1 לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב-336G למשך חמש דקות ב-20 מעלות צלזיוס ושואבת את הסופרנטנט לפני השעיית הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS. שוב, צנטריפוגה של התאים, שאפו כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לכדור ונצמדים, הקפיאו את הגלולה.

למיצוי DNA גנומי יש להשעות את הגלולה עם 50 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי DNA. הפוך אותו להומוגניזציה והעביר את כל הנפח לצינור PCR של 0.2 מיליליטר. מערבל את הצינור וצנטריפוגה אותו לזמן קצר למשך פעימה של שלוש שניות.

מניחים את הצינור במחזור תרמי ומחממים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, יש לדלל את ה-DNA המופק ב-90 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר ב-5000G למשך שלוש שניות. יש לדלל את פריימר ה-PCR במים טהורים במיוחד לריכוז סופי של 10 מיקרומול.

מכינים את תערובת ה-PCR בצינור PCR של 0.2 מיליליטר. הנח את צינורות ה-PCR במחזור התרמי והפעל את התוכנית עם ההגדרות שצוינו. לאוכלוסיות ערוכות רב-שבטיות בשפופרת חדשה של 0.2 מיליליטר.

מערבבים 17.5 מיקרוליטר של אמפליקון ה-PCR עם שני מיקרוליטר של מאגר E שניים לנפח סופי של 19.5 מיקרוליטר. מערבולת את התמיסה והצנטריפוגה בקצרה, לחלופין, לסינון שיבוטים של תא בודד מערבבים את תוצרי ה-PCR מתאי הבקרה הערוכים והלא ערוכים ביחס של אחד לאחד. עבור היווצרות דופלקס הטרו הנח את הצינורות במחזור תרמי והפעל את התוכנית הנתונה.

לאחר היווצרות הטרו-דופלקס מוסיפים 0.5 מיקרוליטר של T שבע אנדונוקלאז תמיסה אחת לצינור ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי להכין את הדגימות לאלקטרופורזה של ג'ל, ערבבו חמישה מיקרוליטרים של תוצרי העיכול T7 endonuclease one או מוצר PCR לא מעוכל עם חמישה מיקרוליטר מים ושני מיקרוליטרים של שישה צבע טעינת xDNA, טענו את הדגימות וסולם הגודל לתוך הג'ל והפעילו את הג'ל ב-80 וולט למשך 45 דקות. עריכת גנים בתיווך CRISPR Cas9 של לוקוס EGFP הביאה לירידה חדה של תאים חיוביים ל-GFP והגיעה להפחתה של יותר מ-90% ביום השביעי לאחר האלקטרופורציה.

ביום השלישי לאחר האלקטרופורציה, מספר התאים ירד בחצי עקב מתח שנגרם על ידי אלקטרופורציה, אך התאושש לחלוטין ביום השביעי במדיום RPMI מלא. אנדונוקלאז T7 נניח ואלקטרופורזה הג'ל של אגרוז הדגימו אובדן של כ-75 שברי זוגות בסיסים בתאים ערוכים המאשרים את עריכת הקריספר של אתר המטרה של EGFP.