יצירת ספרואידים מכונדרוציטים שונים בתנאי הדבקה נמוכה תחת כוח הכבידה ומיני ביוריאקטורים תוצרת בית

תיקון סחוס במחלות מפרקים כרוניות דורש טיפולים מתקדמים מבוססי תאים כדי לחדש רקמות פגועות ביעילות. פרוטוקול זה מספק שיטה שלב אחר שלב להבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לספרואידים מבוססי כונדרוציטים, התומכים בהנדסת רקמות וביישומי תרפיה תאית. תיקון סחוס במחלות מפרקים כרוניות דורש טיפולים מתקדמים מבוססי תאים כדי לחדש רקמות פגועות במידה מספקת.

פרוטוקול זה מספק שיטה שלב אחר שלב להבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לספרואידים מבוססי כונדרוציטים, התומכים בהנדסת רקמות וביישומי תרפיה תאית. האתגרים העיקריים הם מזעור ביטוי קולגן מסוג 1 בתאים שמקורם ב-iPSC כדי למנוע סחוס סיבי, יצירת תנאים להיווצרות סחוס בוגר בקו גבוה, שיפור שיטות תרבית תלת-ממדיות ליציבות ספרואידית, ופיתוח גישות מדרגיות לייצור נפחים קליניים של חומר תאי. הפרוטוקול מספק יתרון על ידי שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כמקור חלופי לכונדרוציטים, המאפשר ייצור מדרגי ללא הליכים פולשניים.

הוא מבטיח תחזוקה טובה יותר של פנוטיפ הכונדרוציטים באמצעות תרבית תלת-ממדית, ומחקה התפתחות סחוס טבעית, וכתוצאה מכך תאים דומים מאוד לכונדרוציטים מקומיים עם ביטוי גבוה של סמנים ספציפיים לסחוס. לפתח שיטות יעילות לשיפור הבשלות והפונקציונליות של כונדרוציטים שמקורם ב-iPSC, להבטיח יציבות ארוכת טווח in vivo, ליצור חומרי תרבית תלת-ממדיים פיברוזיים ולפתח ייצור מדרגי של חומר תאי ליישום קליני. כדי להתחיל, לעקר את המספריים ב autoclave להגדיר 121 מעלות צלזיוס ב 15 פאונד לכל אינץ 'מרובע במשך 30 דקות.

לאחר שהמספריים מתייבשים, פורסים צינורות צנטריפוגות לטבעות בגובה שבעה עד שמונה מילימטרים. כעת מעכו צלחות פטרי בעלות הדבקה נמוכה, לא מטופלות או מיקרוביולוגיות לחתיכות קטנות באמצעות כלי ריסוק מתאים. יש להמיס כגרם אחד של חלקיקי פלסטיק ב-10 מיליליטר כלורופורם למשך הלילה בתוך מכסה אדים.

ודא את צמיגות תמיסת הפלסטיק הנוזלי כדי לוודא שהיא מתאימה לפיפט. אם התמיסה דקה מדי, הוסיפו גרם עד שלושה גרם של חלקיקי פלסטיק נוספים. אם הוא הופך סמיך מדי, לדלל אותו עם כחמישה מיליליטר של כלורופורם.

מניחים טבעת פלסטיק אוטוקלאבית במרכז צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ. לאחר מכן מרחו פלסטיק נוזלי בתוך הטבעת ליצירת ידית פלסטיק. תנו לכלים להתייבש ללא כיסוי במכסה מנוע זרימה למינרית למשך שעתיים-שלוש.

לאחר הייבוש, לחשוף את הכלים לקרינה אולטרה סגולה במשך 20 עד 30 דקות. כדי להתחיל, להשיג את צלחות פטרי שונה המכילים ידיות פלסטיק. יומיים לאחר קציר הסחוס, שטפו חתיכות סחוס בתמיסה של האנק באמצעות צלחות פטרי 60 מ"מ.

לאחר מכן לחתוך את הסחוס לשברים בקוטר של כמילימטר עד שני מילימטרים באמצעות מספריים autoclave. מעבירים חתיכות סחוס לתוך צינור של 15 מיליליטר ומעכלים אותן בתמיסה מסוג 0.01% collagenase מסוג 2 ב- DMEM למשך שמונה עד 12 שעות באינקובטור שייקר מסלולי. לאחר העיכול, מוסיפים את שברי הסחוס עם DMEM וצנטריפוגה את הצינור ב 300 G במשך 10 דקות.

לאחר השלכת תמיסת השטיפה, יש להשהות מחדש את השברים בתרבית כונדרוציטים ולזרוע אותם על בקבוק דבק T25 מצופה מראש בתמיסת ג'לטין 0.1% ולדגור. לאחר מכן, טפחו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בצלחות בנות שש בארות מצופות מראש במטריצה המכילה חלבונים חוץ-תאיים. כדי ליזום התמיינות לקראת השושלת הכונדרוציטית תרבית iPSCs במדיום A במשך היומיים הראשונים.

ביום השלישי, החלף את מדיום A בתמיסה שאינה כוללת CHIR-99021 ומעכב רו-קינאז תוך שמירה על כל שאר הרכיבים ללא שינוי. ביום ה-10, העבירו תאים דמויי כונדרוציטים למדיום B שנוסחו כדי להקל על כונדרוגנזה, ואז המסו 1.5% ארגרוז במיקרוגל למשך כ-60 עד 90 שניות ב-700 וואט. לאחר הנזלה, הוסיפו 75 מיקרוליטר של האגרוז לכל באר של צלחת תרבית תרחיף של 96 בארות ואפשרו לה להתקשות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, להוסיף 150 מיקרוליטר של DMEM לכל באר לדגור את הצלחת באינקובטור פחמן דו חמצני לפחות 12 שעות. ביום ה -12, שימו לב לשינויים הפנוטיפיים הקשורים לאנדרוגנזה כדי להמשיך לחניכה ספרואידית. נתקו תאים במפגש של 80% מהצלחת באמצעות תמיסת טריפסין 0.05%.

לאחר הוספת נפחים שווים של DMEM עם 10% FBS, להעביר את התאים צינור 15 מיליליטר צנטריפוגה ב 200 G במשך חמש דקות. מרחפים מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום B ומעבירים אותם לבקבוק תרבית תאים בגודל 75 ס"מ מרובע המצופה מראש בתמיסת ג'לטין 0.1%. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80% כחד-שכבתיים, מנתקים אותם שוב עם טריפסין ומשעיפים אותם במדיום B.Now מחלקים את התאים לצלחת של 96 בארות מצופות ב-1.5% אגרוז בצפיפות של 100, 000 תאים לבאר, יחד עם 150 מיקרוליטר של B.Incubate בינוני על התאים למשך יום אחד לפחות ומקסימום שלושה ימים עד להיווצרות הספרואידים.

לאחר מכן מעבירים את הספרואידים מהבארות באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד עם קצה גזוז לצינור של 15 מיליליטר. תנו לספרואידים להסתפק בשתיים-שלוש דקות והסירו את הסופרנטנט. כעת טבלו את הספרואידים בתמיסת מטריצת קרום מרתף טרייה מופשרת ולא מדוללת המחוסמת בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הצינור ב 100 G למשך דקה אחת כדי לאסוף את הספרואידים. לבסוף, העבירו את הספרואידים למיני ביוריאקטורים המוכנים והוסיפו שישה מיליליטר של ביוריאקטור בינוני B.הניחו את המיני ביוריאקטור בתוך אינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר 19 ימים של התמיינות, 99% מהתאים ביטאו סמנים כונדרוגניים aggrecan, קולגן סוג אחד, קולגן סוג 2 ו-SOX9.

כונדרוספרות באיכות גבוהה זוהו כאלו עם לפחות 90 עד 95% ביטוי של סמנים גנטיים כונדרוציטים, שהוערכו באמצעות ניתוח ביטוי גנים ביום ה-30 להתמיינות. ספרואידים בוגרים הציגו מורפוגנזה עקבית, שגדלה לקוטר טיפוסי של מילימטר עד שני מילימטרים לאחר חודשיים, כאשר ספרואידים גדולים יותר הראו אזורים מרכזיים עם חללים או נמק.