מערכות מודל רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה

ביופילמים של פלטת שיניים מורכבים ממאות מיקרואורגניזמים שיכולים להניע דלקת באפיתל הפה שלהם, מה שמוביל למחלות כמו דלקת חניכיים. אנו רוצים להבין טוב יותר את האינטראקציות הללו, באמצעות מודלים של רקמות אורגנוטיפיות. מערכות אלו מספקות פלטפורמות שימושיות להערכת שיטות טיפול אלטרנטיביות בצורה מבוקרת.

אז ההתקדמות של טכנולוגיות ריצוף בשנים האחרונות משנה את תחום הביולוגיה של זיהומים. טכנולוגיות אלו מאפשרות לנו לחקור באמת אינטראקציות של פתוגנים מארחים, תוך שימוש בטכניקות OMICs מרובות באמצעות הערכת חתימות מארח ומיקרוביאליות ברמה פרוטאומית, טרנסקריפטומית ומטבולומית. המחקר האחרון שלנו הדגיש את החשיבות של אינטראקציות בין-ממלכתיות ופולי-מיקרוביאליות בזיהומים הקשורים לביופילם.

באמצעות שימוש במערכות מודלים במבחנה, הצלחנו לחקור אינטראקציות ביופילם מארחים, לבחון טיפולים חדשניים נגד ביופילם ולאפיין קהילות מיקרוביאליות, תוך שימוש בטכנולוגיות חדשניות כגון RAM וספקטרוסקופיה. מחקרים עתידיים, תוך שימוש במודלים של רקמות אורגנוטיפיות אלה, ישאפו להשיג חתימה רב-OMIC ופרופיל של המיקרואורגניזם והרקמה המארחת והתרבית, יחד. אנו מקווים לחשוף ולפענח אינטראקציות מורכבות בין המארח לבין חיידקים ומיני פטריות ספציפיים במודלים של הביופילם שלנו.

כדי להתחיל, הסר את הגבעולים הקפואים של חרוזים נקבוביים המכילים מיני סטרפטוקוקוס מ 80 מעלות צלזיוס. להחיות מיני סטרפטוקוקוס על לוחות בסיס מקדחת דם קולומביה, המכילים 5% דם סוס סטרילי דפיבריני. דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.

למחרת, העבירו שלוש עד ארבע מושבות מהצלחת ל -10 מיליליטר של מדיום מרק סויה טריפטון. תרבית את המרק בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 16 עד 18 שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את מתלה התא ב -3, 000 גרם למשך חמש דקות ב -20 מעלות צלזיוס.

שוטפים את כדורי התא עם 10 מיליליטר PBS סטרילי. השעו מחדש את הכדורים ב-10 מיליליטר PBS ותקנו כל תרחיף של זן סטרפטוקוקוס, בנפרד, באמצעות ספקטרופוטומטר המוגדר ל-550 ננומטר. לאחר הסטנדרטיזציה, יש לדלל כל תרחיף סטרפטוקוק, אחד עד 10, כדי להגיע לריכוז של 1 כפול 10 בחזקת שבעה תאים למיליליטר בתערובת של אחד לאחד של מרק טוד יואיט ומדיום מכון רוזוול פארק.

פיפטה 500 מיקרוליטר של מתלי תאים מדוללים לצלחת מיקרוטיטר של 24 בארות, המכילה דיסק הידרוקסיאפטיט של 13 מילימטר. דגרו על התרבית למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר היווצרות ביופילם. באופן דומה, תרבית למיקרואורגניזמים אנאירוביים על בסיס מקדחה אנאירובית קפדנית, המכילה 5% דם סוס דפיברין סטרילי.

תקנן כל מיקרואורגניזם אנאירובי לספיגה ספציפית, ודלל אותם בתערובת אחד לאחד של מרק טוד יואיט ומדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק. לאחר הבשלת ביופילם סטרפטוקוקוס יש להסיר בזהירות תאים שאינם דבוקים ומדיה מבוזבזת מהבארות. הוסף 500 מיקרוליטר מתוקננים אחד כפול 10 לעוצמה של שבעה תאים למיליליטר תרחיפים של ארבעה מיקרואורגניזמים אנאירוביים לכל באר.

דגרו על הביופילמים למשך 24 שעות בתנאים אנאירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר תאים לא דבוקים ומדיה משומשת מהבארות. הוסף 500 מיקרוליטר של תערובת סטרילית אחד לאחד של מרק טוד יואיט ומדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק.

תרבית הביופילמים בתנאים אנאירוביים למשך 24 שעות. ביום השביעי, שטפו את הביופילמים פעמיים עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי לתרבית משותפת. כדי להתחיל, פתח את הקופסה והעבר את האפיתל האוראלי האנושי או רקמת ה-HOE והמדיה לארון בטיחות מסוג 2.

הוסף מיליליטר אחד מאמצעי התחזוקה המסופק עם הרקמה לכל באר של צלחת 12 בארות. בעזרת פינצטה סטרילית, הסר את תוספות הפוליקרבונט המכילות את רקמת ה-HOE ממקדחת ההזנה, וצלחת משלוח 24 בארות. העבירו את הרקמה לצלחת 12 הבאר המוכנה.

דגרו על דגמי הרקמות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני כדי להתאקלם בתנאי מעבדה. בינתיים, כדי להסיר את הביופילמים מדיסקי ההידרוקסיאפטיט, השתמש במחט ובפינצטה בגודל 19 כדי להרים את הדיסקים מתחתית צלחת 24 הבארות. העבירו את הדיסקים לביז'ו, המכיל מיליליטר אחד של DPBS סטרילי.

סוניקציה של הדיסקים ב-35 קילו-הרץ למשך 10 דקות באמבט מים סוניקציה. לאחר ההתאקלמות, השתמש בפינצטה כדי להסיר את תוספות הרקמה מצלחת 12 הבארות. פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף סוניקט הביופילם ישירות על דגמי הרקמות.

העבירו את התוספות לצלחת נוספת של 12 בארות המכילה מיליליטר אחד של אמצעי תחזוקה טריים. דגרו על דגמי הרקמות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לעיבוד רקמות, הכינו 350 מיקרוליטר של מאגר RLT-lysis, המכיל 1% קרן מרקפטואתנול בצינור טבעת O של מכסה בורג של שני מיליליטר.

הוסף לצינור כ -100 מיקרוליטר של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה של 0.5 מילימטר. בעזרת פינצטה, הסר את התוספות המכילות את הרקמה מהמדיה והשליך את כל התרחיף המיקרוביאלי שנותר מהתצוגה. החזק את התוספת הפוכה בגובה העיניים, ולאחר מכן השתמש במחט בגודל 19 כדי לפרוס בזהירות את הרקמה והממברנה מתחתית התוספת.

העבירו את הרקמה והממברנה למאגר ה-RLT המוכן. הומוגניזציה של הרקמה למשך 30 שניות, באמצעות הומוגנייזר חרוזי חרוזים ספסל. חלץ RNA מהליזט שנוצר, בהתאם לערכת מיצוי ה-RNA של הוראות היצרן.

אסוף את מדיית הרקמה המושקעת הנותרת לניתוחים פרוטאומיים, תוך שימוש במתודולוגיות תפוקה נמוכה וגבוהה. ביטוי הגנים של סמנים ביולוגיים דלקתיים ברקמת ה-HOE היה מווסת באופן משמעותי לאחר חשיפה לביופילם סוניקט, בהשוואה לבקרה הלא מגורה. שינויי הקיפול הגדולים ביותר נצפו עבור CCL2, CXCL1 ו-CSF3.

ביטוי ה-mRNA של IL8 ברקמת HOE גדל פי 8.67, לאחר גירוי עם ביופילם סוניקט, בהשוואה לרקמה מבוקרת. רמות חלבון IL8 במדיה המושקעת עלו מ-1.005 ננוגרם למיליליטר ברקמת הביקורת ל-4.245 ננוגרם למיליליטר ברקמה מגורה ביופילם סוניקט.