Name: אופטימיזציה של תגובת שעתוק במבחנה לייצור mRNA באמצעות ניטור כרומטוגרפי בקו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: למד שיטת כרומטוגרפיה מהירה לניטור בזמן אמת של תגובות שעתוק במבחנה לייצור mRNA. השיטה מאפשרת מעקב אחר צריכת NTP וייצור mRNA בו-זמנית, מייעלת את התגובה ומפחיתה עלויות תוך הגברת התפוקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).</li>
<li>Baden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+the+mRNA-1273+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine.</a> N Engl J Med. 384 (5), 403(2021).</li>
<li>Lopez Bernal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+Covid-19+Vaccines+against+the+B.1.617.2+%28Delta%29+Variant%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of Covid-19 Vaccines against the B.1.617.2 (Delta) Variant.</a> N Engl J Med. 385 (7), 585-594 (2021).</li>
<li>Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics+-+developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics - developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13, 759-780 (2014).</li>
<li>Baptista, B. R., Carapito, N., Pichon, C., Sousa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA%2C+a+revolution+in+Biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">mRNA, a revolution in Biomedicine.</a> Pharmaceutics. 13, 2090(2021).</li>
<li>Rosa, S. S., Prazeres, D. M. F., Azevedo, A. M., Marques, M. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+manufacturing%3A+Challenges+and+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines manufacturing: Challenges and bottlenecks.</a> Vaccine. 39, 2190(2021).</li>
<li>Whitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mRNA+manufacturing+for+vaccines+and+therapeutics%3A+mRNA+platform+requirements+and+development+of+a+scalable+production+process+to+support+early+phase+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials.</a> Transl. Res. 242, 38-55 (2022).</li>
<li>Kis, Z., Kontoravdi, C., Shattock, R., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources%2C+production+scales+and+time+required+for+producing+RNA+vaccines+for+the+global+pandemic+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Resources, production scales and time required for producing RNA vaccines for the global pandemic demand.</a> Vaccines. 9 (1), 3(2021).</li>
<li>Hengelbrock, A., Schmidt, A., Helgers, H., Vetter, F. L., Strube, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+machine+for+regulatory+approval+of+variable+scale+between+1000+clinical+doses+to+10+million+manufacturing+scale+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA machine for regulatory approval of variable scale between 1000 clinical doses to 10 million manufacturing scale doses.</a> Processes. 11, 745(2023).</li>
<li>Rosa, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mRNA+vaccine+production+with+Bayesian+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (11), 3127-3139 (2022).</li>
<li>Sari, Y., Sousa, S. S., Jeffries, J., Marques, M. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+T7+promoter+for+enhanced+yield+and+quality+in+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of T7 promoter for enhanced yield and quality in mRNA production.</a> Sci Rep. 14, 9655(2024).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+vaccine+development+landscape+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mRNA vaccine development landscape for infectious diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 333-334 (2022).</li>
<li>Pregeljc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yield+of+in+vitro+transcription+reaction+with+at-line+high+pressure+liquid+chromatography+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).</li>
<li>Kern, J. A., Davis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fed-batch+system+to+produce+RNA+by+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription.</a> Biotechnol Prog. 15 (2), 174-184 (1999).</li>
<li>Skok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-Scale+mRNA+Production+Using+a+250-mL+Single-Use+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemie+Ingenieur+Technik%22%5BJournal%5D)">Gram-Scale mRNA Production Using a 250-mL Single-Use Bioreactor.</a> Chemie Ingenieur Technik. 94 (12), 1928-1935 (2022).</li>
<li>Welbourne, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+exchange+HPLC+monitoring+of+mRNA+in+vitro+transcription+reactions+to+support+mRNA+manufacturing+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development.</a> Front Mol Biosci. 11, 1250833(2024).</li>
<li>Lee, K. H., Song, J., Kim, S., Han, S. R., Lee, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+strategies+for+optimization+of+in+vitro+transcription+and+quality+control+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring strategies for optimization of in vitro transcription and quality control of RNA.</a> Front Mol Biosci. 10, 1229246(2023).</li>
<li>Matuszczyk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+provides+valuable+process+insights+for+cell-derived+and+cellular+products%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products.</a> Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).</li>
<li>Mu, X., Hur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of in vitro-transcribed RNA.</a> Acc Chem Res. 54 (21), 4012-4023 (2021).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+particle+as+an+RNA+adsorbent+for+facile+purification+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).</li>
<li>Ziegenhals, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dsRNA+by-products+during+in+vitro+transcription+can+be+reduced+by+using+low+steady-state+levels+of+UTP%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP.</a> Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).</li>
<li>Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+aptamer-based+real-time+monitoring+of+enzymatic+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis.</a> J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן ממברנה PES, למשל. צינורות פלסטיק Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td> 0.5 מ"ל; לדוגמה צינורות פלסטיק של Sartolab BT 500 Sartorius 180E14E <td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל; לדוגמה צינורות פלסטיק</td> של <td></td><td></td> 1.5 <td></td></tr> מ"ל של Sartolab BT, <tr><td>צינורות פלסטיק נקיים של 30108035</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>של תמיסת ATP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R1331T2 מצנן ספסל -20 מעלות; C</td><td>מותג</td><td>114935</td><td></td></tr><tr><td>CIMac PrimaS 0.1 מ"ל עמודה אנליטית (2 ומיקרו; מ)</td> <td>הפרדות Sartorius BIA</td><td>110.5118-2, 2 ומיקרו; m ערוצי</td><td></td></tr><tr><td>פתרון CTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R3331T2</tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 x 2H2O</td><td>Kemika&nbsp;</td><td>לדוגמה 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>פתרון GTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R2331T2</tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC בקבוקון התאוששות גבוהה</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM 9530G</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td><td>Thermo Scientic</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>mRNA standard, mFix4, 4000 nt</td><td>Sartorius BIA הפרדות</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>PATfix פלטפורמה אנליטית mRNA&nbsp;</td><td>הפרדות Sartorius BIA PAT0021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה 100 &ndash; 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 2 &ndash; 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20 &ndash; 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophosphatase</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טיהור Rnase</td><td>Thermo Scientic</td><td>10328011</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNAse</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>RNK3501</tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>T7 mRNA polymerase</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Thermo Scientic</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת UTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R5331T2</tr><tr><td>כמוסות בקבוקון</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה של תגובת שעתוק במבחנה לייצור mrna באמצעות ניטור כרומטוגרפי בקו

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

הניתוח הכרומטוגרפי המתואר בפרוטוקול זה יכול לשמש לאופטימיזציה של IVT או להמרת תגובת IVT אצווה לתגובת אצווה מוזנת (איור 1).
כדי לבחון את ההשפעה של הרכבי חיץ שונים על הקינטיקה של תגובת IVT, עורבבו שלוש תגובות IVT שונות על פי הפרוטוקול הכתוב בטבלה 2. בופר המכיל Tris, שבו ה-pH הותאם עם HCl, הושווה למאגר Tris, שבו ה-pH הותאם עם חומצה אצטית. יתר על כן, שני מאגרי Tris הושוו למאגר HEPES, שם ה-pH הותאם עם NaOH. כל ההרכב של מאגר IVT 1x היה 40 מ"מ Tris/HEPES, 10 מ"מ DTT, 2 מ"מ ספרמידין ו-pH 7.9.
מ-100 מיקרוליטר של תערובת תגובות IVT, 2 מיקרוליטר של דגימת IVT הוצאו מתגובת IVT והורו ב-2 מיקרוליטר של 100 מ"מ EDTA כל 15 דקות בשעה הראשונה של הדגירה ולאחר מכן כל 30 דקות עד 180 דקות של הדגירה. תפוקת ה-mRNA הסופית הצפויה למצב תגובה זה הייתה 15 מ"ג/מ"ל, כלומר דילול פי 2 עקב מרווה לווה בדילול פי 400 ב-MPA+NaCl לניתוח. הדגימה דוללה פי 800 בסך הכל, כלומר אפילו בייצור של 15 מ"ג/מ"ל, ריכוז ה-mRNA שהועמס על העמודה הכרומטוגרפית האנליטית עדיין היה בריכוזי עקומת הכיול.
אזורי NTP ו-mRNA ב-A260 שולבו עבור כל דגימה בודדת בכל נקודת זמן בודדת (tx). לאחר מכן הומרו אזורים לריכוזים עבור mRNA, תוך שימוש בעקומת כיול ה-mRNA ואחוז הצריכה עבור NTPs, תוך שימוש בשטח A260 של NTPs ב-0 דקות (t0) כ-100% (ראה משוואה למטה).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;">
ניתן להציג את התוצאות כגרפים עבור כל תגובת IVT בודדת, כאשר הזמן מוצג על ציר ה-x וריכוז ה-mRNA ושאר ה-NTPs מוצגים על ציר ה-y (איור 2A). ניתן גם לשרטט את כל ה-IVT, כלומר ריכוזי mRNA בתלות בזמן, בגרף אחד, וניתן לחקור קינטיקה של ייצור mRNA ולבחור תנאי IVT אופטימליים (איור 2B).
עבור ניסוי האצווה הפדרלית, IVT היה מעורבב כפי שכתוב בטבלה 3. מ-300 מיקרוליטר של תערובת תגובת IVT, 2 מיקרוליטר של דגימת IVT הוסרו מתגובת IVT ורוו ב-2 מיקרוליטר של 100 מ"מ EDTA כל 30 דקות. בנוסף, הדגימה נלקחה מיד לאחר כל תוספת NTP+MgCl2 בתפזורת. תמיסת הזנה המכילה 42.4 מ"מ מכל NTP ו-152.5 מ"מ MgCl2 הוכנה מראש, ו-106 מיקרוליטר מכל 200 מ"מ NTP מעורבב עם 76.2 מיקרוליטר של 1 מ"מ MgCl2. הוקם משטר האכלה, שבו הוסיפו הזנת בולוס כל שעה (לאחר 60 דקות, 120 דקות, 180 דקות ו-240 דקות דגירה). משטר ההזנה מתואר בטבלה 3 הדגימות נותחו כמעט בזמן אמת עם ניתוח כמתואר עבור תגובת IVT בתפזורת. לאחר 300 דקות של ניטור תגובת ה-IVT דועכה.
ניתן להציג את התוצאות כייצור NTPs/mRNA שנותר לאורך זמן הדגירה. מכיוון שתוספות מזון בולוס גם מדללות את תגובת ה-IVT, ריכוז ה-mRNA ב-IVT יורד בכל תוספת הזנה (איור 3A). עלייה במסת ה-mRNA יכולה להימדד ולהיות מוצגת גם על ידי גורמי שעתוק (המוגדרים כ-mmRNA/mpDNA), המראים עלייה ליניארית בייצור mRNA לאורך זמן (איור 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg"> 
איור 1: סקירה סכמטית (A) ייצוג של זרימת עבודה של אופטימיזציה של IVT עם כימות ניתוח כרומטוגרפי מקוון של NTPs ו-mRNA. (B) כרומטוגרמות מייצגות של תגובת IVT אצווה שנדגמו ב-(i) t0, (ii) נקודת אמצע, (iii) נקודות זמן תגובה סופיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg"> 
איור 2: גרפים IVT אצווה. (A) גרף מייצג של תגובת IVT עם ייצור mRNA וצריכת NTP על ציר ה-y. מישור ריכוז mRNA הנראה ב-120 - 180 דקות של דגירה, המתאם עם צריכת NTP כהגבלת NTP (ATP) נצרך ב-120 דקות. (B) גרף IVT המראה את ההשפעה של מאגר IVT על קינטיקה של IVT. IVT המכיל Buffer A (Tris+חומצה אצטית) הראה את ייצור ה-mRNA המהיר ביותר, ואחריו Buffer B (Tris+HCl) ו-Buffer C (HEPES+NaOH) כאיטי ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg"> 
איור 3: גרף IVT של אצווה פד. (A) גרף IVT שבו הזנות NTP+MgCl2 נוספו ב-60, 120, 180 ו-240 דקות. ריכוז ה-mRNA בתגובת IVT יורד בכל תוספת הזנה עקב דילול עם הזנת NTP+MgCl2 . (B) עלייה במסת ה-mRNA שמוצגת על ידי גורם השעתוק היא ליניארית לאורך כל הדגירה של התגובה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: פרוטוקול IVT גנרי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>
טבלה 2: פרוטוקול IVT אצווה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>
טבלה 3: פרוטוקול IVT של אצווה פד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>

אופטימיזציה של תגובת שעתוק במבחנה לייצור mRNA באמצעות ניטור כרומטוגרפי בקו

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

optimization-vitro-transcription-reaction-for-mrna-production-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של ​​הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

פרוטוקול זה מספק חוקרים עם כלי חדש כדי לפקח על הנאמנות של שעתוק אורגניזמים דגם מרובים.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

פרוטוקול זה מודד כמותית את היציבות ומחצית החיים של RNA מגביר בין-גני ותוך-גני בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות טיפול אקטינומיצין D, RT-qPCR וניתוח רגרסיה לא ליניארית. אסטרטגיות נרמול ספציפיות למיקום משולבות כדי למודל במדויק את דינמיקות דעיכת eRNA באופן תלוי הקשר.

הערכה כמותית אופטימלית של יציבות RNA משפר בתאי גזע עובריים בעכבר

למד שיטת כרומטוגרפיה מהירה לניטור בזמן אמת של תגובות שעתוק במבחנה לייצור mRNA. השיטה מאפשרת מעקב אחר צריכת NTP וייצור mRNA בו-זמנית, מייעלת את התגובה ומפחיתה עלויות תוך הגברת התפוקה.

אופטימיזציה של תגובת שעתוק במבחנה לייצור mRNA באמצעות ניטור כרומטוגרפי בקו

גלה סרטונים נוספים