הערכה של גנים חריגים הקשורים לגדילה של תאי גזע ואב המטופויאטיים על ידי שילוב של טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם ספירת תאים

היקף המחקר הוא פתוגנזה של לוקמיה. אנו שואפים לזהות גנים קריטיים להתפשטות חריגה של HSPC על ידי שילוב עם CRISPR/Cas9 עם מבחני CCK-8, וחושפים את תפקידיהם בגידול ואת הפוטנציאל כמטרות תרופתיות.

עריכת גנים מבוססת CRISPR/Cas-9 מספקת גישה פשוטה ויעילה להשגת נוקאאוט גנים בתאים האיקריוטיים שלך. האתגר הניסויי הנוכחי הוא להגדיל עוד יותר את יעילות הנוקאאוט של CRISPR/Cas-9.

הפרוטוקול שלנו משתמש בעכברי Cas-9 כדי לספק לתאי מח עצם ביטוי Cas-9 מייעץ, ובכך להעביר ויראלית של SGI לתאים, ובכך לשפר מאוד את יעילות הניסוי.

[מגישה] כדי להתחיל, השג את עצם הירך והשוקה מעכבר הניסוי שעבר המתת חסד. העבירו את עצם הירך והשוקה למכסה זרימה למינרי מיד לאחר ההסרה כדי לשמור על סטריליות. בעזרת מזרק סטרילי של מיליליטר אחד, שטפו את חלל מח העצם עם PBS המכיל 2% FBS כדי לאסוף תאי מח עצם. פיפטה את תאי מח העצם למעלה ולמטה 30 עד 50 פעמים כדי לפזר אותם לתאים בודדים. מעבירים את תערובת התאים לצינור של 50 מיליליטר ומערבולת לערבב היטב. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התא ל-40 מיקרוליטר של מאגר ליזה של אריתרוציטים, והניח אותו על קרח למשך חמש דקות כדי לליז את האריתרוציטים. לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסה כחולה של טריפאן. מערבבים היטב וסופרים תאים ברי קיימא. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-800 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושאבו את הסופרנטנט. לאחר מכן השעו מחדש את התאים בריכוז של אחד עד פעמיים פי 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר במח העצם, מדיום קדם גירוי. וזרע 10 מיליליטר מהמתלה לכלי של 10 סנטימטרים. דגרו את המנה למשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. כדי לאסוף את התאים המגורים מראש למחרת, הוסיפו חמישה עד 10 מיליליטר PBS המכילים 2% FBS ושטפו את הצלחת במרץ. העבירו את התאים לצינור טרי, והוסיפו טריפן כחול לתאים. ספרו תאים ברי קיימא בתערובת. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 800 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים בתמיסת זיהום טרייה שהוכנה בריכוז של כ-10 בחזקת שישה תאים למיליליטר. זרע ארבעה מיליליטר מהמתלה לכל באר של צלחת שש בארות. אוטמים את הצלחת עם פרפילם וצנטריפוגה בחום של 1,500 גרם למשך 90 דקות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השעו בעדינות את התאים בעזרת פיפטה מבלי לשנות את המדיום. דגרו על הצלחת למשך ארבע עד שש שעות. עבור הטרנספקציה הראשונה, שאפו כשלושה מיליליטר של מדיום סופרנטנט מכל באר לתוך צינור, והוסיפו נפח שווה של מדיום קדם גירוי מח עצם. אם תאים נשאבים בטעות, חזור על שלבי הצנטריפוגה וההשעיה מחדש כמתואר קודם לכן. עבור הטרנספקציה המשנית, למחרת, הסר שניים עד שלושה מיליליטר של מדיום מכל באר והוסף נפח שווה של תמיסת מלאי רטרו-ויראלית שזה עתה הופשרה יחד עם כמויות מתאימות של hepas ופוליגרין. צנטריפוגה את הצלחת ב -1,500 גרם למשך 90 דקות ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש בעדינות את התאים והמשיכו לדגור במשך ארבע עד שש שעות. כעת, החלף את המדיום כפי שתואר קודם לכן ודגר למשך 24 שעות. שוטפים את הצלחת עם PBS המכיל 2% FBS ואוספים את התאים. סנן את התאים דרך מסננת של 70 מיקרומטר לפני ספירת התאים הקיימים באמצעות טריפן כחול. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 800 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את התאים ב-DMEM המכילים 10% FBS ואינטרלוקין-3 עכברי, אינטרלוקין-6 וגורם תאי גזע. צנטריפוגה בערך 0.5 עד 1x10 בחזקת שישה תאים ב-800 G למשך חמש דקות ולהשליך את הסופרנטנט. אחסן את כדור התא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למיצוי DNA גנומי. כעת, הוסף 1x10 לעוצמה של ארבעה תאים לבאר לצלחת של 96 בארות, מה שהופך שש בארות שכפול לכל קבוצה. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי לבארות שמסביב ודגרו עד לנקודות זמן שונות של 0, 24, 48 ו-72 שעות. שאפו את המדיום בכל נקודת זמן, והוסיפו לבארות 110 מיקרוליטר של מדיום המכיל 1/10 נפח של תמיסת CCK-8. דוגרים על התערובת למשך שעה. לבסוף, מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה. נוקאאוט Trp53 הגדיל משמעותית את יכולת ההתפשטות של עכבר, גזע המטופויאטי ותאי אב בהשוואה לביקורת ב-24, 48 ו-72 שעות כפי שנמדד על ידי מבחן CCK-8. יעילות העריכה של Trp53 הוערכה ב-7.3% באמצעות ניתוח TIDE. וריצוף הדור הבא חשף מוטציות המתרחשות במיקומים שונים בגן.