מכשיר מתיחה שווה צירי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בהגדלה גבוהה

אנו חוקרים כיצד תאים מגיבים ומסתגלים לגירויים מכניים בהקשר פיזיולוגי ופתולוגי. לשם כך אנו משתמשים במכשיר המתיחה כדי להפעיל כוחות חיצוניים, מתח במקרה זה, על תאים.

מצאנו כיצד תאים ורקמות תאים מגיבים לגירויים מכניים ספציפיים וכיצד הם מגיבים מכנית לרמזים ביולוגיים אחרים.

מכשיר המתיחה שלנו הוא תכליתי מאוד בהשוואה לאחרים מכיוון שהוא מציע אפשרות למתוח תאים שגודלו על ג'לים פוליאקרילאמיד בעלי קשיחות שונה או לבצע ניסויי דחיסה.

[קריין] כדי להתחיל, הניחו את טבעות ה- PMMA על דף נייר ספסל לבן. הסתובב בזהירות סביב קצה הצלחת המצופה PDMS באמצעות להב כדי להבטיח חיתוך נקי לאורך כל ההיקף. השתמש בפינצטה כדי להרים את הממברנה בקצה אחד, ולאחר מכן קלף אותה בעדינות עם האגודל כדי לנתק באופן שווה מחצית מהקרום מהצלחת. השתמש באצבעות כדי לפזר 96% אתנול באופן שווה על כל המשטח העליון של טבעת ה-PMMA. הסר בזהירות את קרום ה-PDMS מהצלחת על ידי הרמתו מהקצה המורם בעבר. לאחר מכן, הנח אותו בצורה סימטרית על טבעת ה-PMMA המכוסה באתנול, והבטיח שאין קמטים תוך הימנעות ממתיחות. לאחר מכן, קח טבעת PMMA ריקה נוספת והנח אותה על גבי טבעת ההרכבה. השתמש בקליפסים מתכתיים כדי לאטום אותם יחד, סנדוויץ' את קרום ה-PDMS בין שתי הטבעות. מקם את החצי התחתון של טבעת המתיחה על תומך ההרכבה. הנח את טבעת ה-PDMS דבוקה על טבעת המתיחה ודחף אותה כלפי מטה בחוזקה עד שהיא יושבת במלואה, וודא שהאטם ממוקם כהלכה. הנח את משקולות הפליז העגולות על גבי הדגימה. לאחר מכן, הניחו את המחצית העליונה של טבעת המתיחה המתכתית מעל, יישרו את חורי הברגים. הכנס את כל הברגים והדק אותם. חותכים את ה-PDMS סביב הטבעת בעדינות בעזרת להב. מכסים את המכלול בצלחת פטרי כדי להגן על הממברנה מפני אבק. הכן דילול אחד של 250,000 של חרוזי פלורסנט של 0.2 מיקרומטר ב-PBS באמצעות דילול סדרתי. והניחו טיפה של 10 עד 30 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים במרכז ה-PDMS. הניחו לו להתייבש בטמפרטורה שאינה גבוהה מ-40 מעלות צלזיוס כדי למנוע בעיות מבלבלות לאחר ריפוי. כעת, התקן את מכשיר המתיחה על מחזיק הבמה של המיקרוסקופ ואבטח את מוט המתיחה על המיקרוסקופ. מרחו בנדיבות חומר סיכה על האזור העגול של העמוד. התקן את טבעת המתיחה המוכנה על מוט המתיחה והברג את המכסה העליון כדי לאטום את המכלול. לאחר מכן, חבר את החלק האחורי של תיבת בקרת הוואקום למקור הוואקום, ואחריו את החלק הקדמי של הקופסה לעמוד המתיחה. כדי לבצע כיול מתח, בחר תחום עניין המכיל צפיפות חרוזים גבוהה וגושי חרוזים הניתנים לזיהוי עבור המשתמש. רכוש תמונה בשאר שדה הראייה שנבחר ושמור את המיקום. החל מתיחה ברמת ואקום נמוכה של 20 מיליבר שלילי, הגורמת לתנועה לכל הכיוונים. כעת, התמקדו מחדש במישור Z והזיזו את הבמה בכיווני XY כדי לאתר את אותו אזור עניין ולרכוש תמונה במצב מתוח. לאחר מכן, שחררו את המתח וחזרו על השלבים עם רמת ואקום גבוהה יותר. אחסן תמונות שנרכשו בתיקיה המאורגנת לפי דוגמה. שם, תמונת חרוז הייחוס שנרכשה ללא מתיחה reference_str1 והתמונות נמתחות ברמות ואקום הולכות וגדלות כמו stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 וכן הלאה. כדי לכמת את הזן, פתח את MATLAB וטען את קוד זן הג'ל. לאחר הגדרת הפרמטרים, הגדר את נתיבי האב, כמו גם את נתיבי תיקיית הניסוי והפעל את הקוד. לאחר מכן, פתח את stretched_str1 לפי בקשת הקוד, ואחריו את reference_str1. כעת, חשב את מטריצת המתח החציונית עבור כל רמת ואקום. לאחר חזרה על תהליך זה עבור שלוש דוגמאות לפחות, שרטט את מטריצת המתח החציונית לעומת רמת הוואקום כדי לקבל את עקומת הכיול. כדי לצפות את טבעת ה-PDMS, יש לעקר אותה באור אולטרה סגול למשך 15 דקות. מתחת לארון בטיחות ביולוגית, שטפו את הצלחת מתחת למכסה המנוע עם PBS סטרילי. לאחר שאיבת כל ה- PBS המשמש לשטיפת הצלחת. הפקידו טיפה של 100 עד 200 מיקרוליטר מהתמיסה במרכז הטבעת. צייר את היקף הטיפה עם טוש קבוע מהצד התחתון של קרום ה-PDMS ודגר אותו. ביום הניסוי יש לשטוף את חלבון ההדבקה עם PBS. לאחר ניסיון התאים, המשך לספירת תאים. זרע מספר מתאים של תאים בנפח קטן של כ-20 עד 50 מיקרוליטר עם מדיה תאית סטנדרטית כדי לקדם התקשרות ולדגור אותה בחממת פחמן דו חמצני עם בקרת לחות. לאחר 20 עד 30 דקות, הוסיפו בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיה על גבי התאים והחזירו את הצלחת לחממה כדי לאפשר התפשטות נוספת של התאים. למחזור שחרור מתיחה בודד והדמיה, הרכיב את טבעת המתיחה על שלב המיקרוסקופ כפי שהודגם קודם לכן. לאחר איתור תא מעניין, רשום את מיקומו וצלם תמונה של התא המתוח מראש. החל את רמת הוואקום הרצויה המתאימה למתח המצע הנדרש על סמך עקומת הכיול כדי למתוח את התא. כדי לאתר את תא המתיחה, ראשית, התמקד מחדש במישור Z. לאחר מכן, עבור בכיווני XY כדי למרכז את התא בשדה הראייה. הקלט תמונות במהלך משך הזמן הרצוי. נווט למיקום המקורי של התא והפעל את מצב הרכישה של המיקרוסקופ כדי להבטיח שצילום התמונה יתחיל מיד עם המיקוד מחדש. שחרר את המתיחה והתמקד מחדש במהירות באופן ידני במישור Z. צלם תמונות של התא המשוחרר למשך הזמן הנדרש, תוך התאמת המיקוד באופן ידני לאורך כל הרכישה. לעיבוד שלאחר מכן, פתח את פיג'י וטען את התמונות שנרכשו במנוחה ובזמן מאמץ. השתמש בתבנית התוסף התואמת של פיג'י כדי לבחור אזור בתא ליישור. הכיול הבטיח יכולת שחזור ושליטה על המתח המופעל, ואישר קשר כמעט ליניארי בין ואקום למתח עד 20%. ניתוח תזוזה רדיאלי הדגים איזוטרופיה והומוגניות של מתח מעל קרום ה-PDMS. הדמיה פלואורסצנטית של תאים פיברובלסטים תחת מתיחת תאים חיים חשפה פלישות של הממברנה עם שחרור המתיחה, שנספגה מחדש תוך שלוש עד חמש דקות. מתיחה מחדש של תאים קבועים אפשרה הדמיה במצב מתוח, ומנעה קיפול מלאכותי של חפצים. ממברנת PDMS עם רשת מעוצבת אפשרה הדמיה מולטי-מודאלית, ואפשרה לוקליזציה של אותם תאים במיקרוסקופ אלקטרונים פלואורסצנטי וסריקה. תאים שישבו על ג'ל PAA רך המצופה בפיברונקטין יצרו הידבקויות מוקדיות רק כאשר הוגשו למחזורי מתיחה מחזוריים ספציפיים בהשוואה לתאים לא מתוחים.