לכידת שברי אתרים שבירים נפוצים על ידי γH2A מקורי. X ChIP

המותרות שלנו מתמקדות באובדן היכרויות, התפקיד של חוסר יציבות אתר שביר נפוץ בג'ייב בהתהוות מחדש של הגידול. נסה לזהות ניידות נגיפית בתאי סרטן גירון אונקוגנים שניתן לנצל באופן טיפולי. אחרת, הדמיה וטכנולוגיות הריצוף, כגון סימפתיה של תא בודד והדמיית תאים חיים מספקות מיפוי ברזולוציה גבוהה של חוסר יציבות גנומית במסה.

מודלים של אזור in vivo כולל רעש, מודלים של עכברים מהונדסים גנטית ומערכות בסיס CRISPR סביבנו כדי לחקור בפירוט את המנגנונים של חוסר יציבות גנומית אונקוגן. האינטרס ארוך הטווח של המעבדה שלנו הוא לזהות חולשות ספציפיות בתאים סרטניים שניתן לטפל בהן באופן אסטרטגי לטיפולים נגועים תוך התמקדות במזעור הנזק לתאים נורמליים. זה כולל חקירת פגיעויות גנטיות ואפיגנטיות כדי לחשוף הזדמנויות טיפוליות נורמליות.

כדי להתחיל, טפל בתאי HEK 293 T עם DMSO אתיל דקולין והידרוקסיאוריאה בשלוש צלחות שונות למשך 24 שעות. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS, צנטריפוגה אותם ב -500 גרם ארבע, חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר קר טרי שהוכן A, ודגרו על קרח למשך חמש עד 10 דקות.

התבונן בהתקדמות הליזיס תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר ליזיס תאים מלא. לאחר הליזה, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשעיה מחדש של גלולת הגרעינים ב-500 מיקרוליטר של מאגר קר A.צנטריפוגה שוב, והשעיה מחדש של הגרעינים השלמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר נוקלאז מיקרוקוקלי על ידי פיפטינג חמש עד 10 פעמים. הוסף מיד את הכמות שנקבעה מראש של נוקלאז מיקרוקוקלי לדגימות.

הניחו את הצינורות על מסובב למשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. החזירו מיד את הצינורות לקרח, והוסיפו EDTA כדי להפסיק את העיכול. לאחר המערבולת, מוסיפים 500 מיקרוליטר של מאגר B ופיפטה למעלה ולמטה לערבוב.

דגרו את הצינור על קרח למשך חמש דקות כדי להמיס את החלבונים. כדי לגלול את החומר הבלתי מסיס, צנטריפוגה את הדגימות במהירות מקסימלית למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט השקוף לשפופרות חדשות של 1.5 מיליליטר, המסומנות כשבר הכרומטין המקורי.

כדי לאמת פיצול כרומטין, יש להוציא 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט לתוך צינור חדש של 1.5 מיליליטר. מערבבים את הסופרנטנט עם 20 מיקרוליטר מים מזוקקים ו -30 מיקרוליטר אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם. לאחר מערבולת נמרצת, צנטריפוגה את הצינורות ב-20,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס והתבוננו בשלוש שכבות נפרדות: שכבה עליונה שקופה, שכבה אמצעית לבנה ושכבה תחתונה צהובה.

העבירו בזהירות 20 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון, המכילים DNA לצינור טרי. הפרד את ה-DNA המטוהר בג'ל אגרוז של 1.5% למשך 30 דקות ב-100 וולט. דמיין את דפוסי העיכול, וודא שגודל שברי הכרומטין הוא בעיקר בין 200 ל -1,000 זוגות בסיסים.

העבירו 20 מיקרוליטר של כרומטין מעוכל לכל צינור, המכיל 180 מיקרוליטר של מאגר פליטה. סמן את הצינורות כדוגמאות קלט, ואחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. הוסף 400 מיקרוליטר של כרומטין מעוכל לתוך שפופרת נוספת של 1.5 מיליליטר עבור משקעים חיסוניים של כרומטין, או שבב.

העברת נוגדן גמא H2 AX לדגימה שטופלה ב-DMSO, אתיל דקולין שטופלה והידרוקסיאוריאה. הניחו את הצינורות על מסובב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש שעות, או רצוי למשך הלילה. בינתיים, באמצעות קצות פתחים רחבים, הכניסו 100 מיקרוליטר של חרוזי חלבון מגנטי AG בדרגת שבב לתוך צינור חדש של 1.5 מיליליטר.

הנח את הצינור על מעמד מגנטי למשך דקה אחת, ולאחר מכן השליך בזהירות את הנוזל. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של PBS המכיל 0.5% BSA. סובב את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

הנח את הצינור בחזרה על המעמד המגנטי למשך דקה אחת והשליך את הסופרנטנט. לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את החרוזים המקודדים מראש ב-100 מיקרוליטר של מאגר B.הוסף 25 מיקרוליטר של מתלה החרוזים המגנטי המקודד מראש לכל צינור דגימת שבב. סובב את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ואז הנח את צינורות השבב על מעמד מגנטי והמתן עד שהחרוזים יתחברו לצד הצינור והתמיסה תתבהר.

השליכו את הסופרנטנט השקוף מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים. השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר כביסה וסובבו בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הנח את הצינורות בחזרה על המעמד המגנטי והמתן עד שהתמיסה תתבהר לפני השלכת מאגר הכביסה.

לאחר הכביסה הסופית, צנטריפוגה קצרה את הצינורות ב-400 גרם למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות נוזל. הנח את הצינורות בחזרה על המעמד המגנטי והסר בזהירות את כל הנוזלים שנותרו מתחתית הצינור. לאחר אימות יעילות משיכת נוגדן השבב, באמצעות כתם מערבי, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה לכל אחת מדגימות השבב הנותרות.

מניחים את הצינורות על מערבל תרמה ומנערים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הצינורות על מחזיק מגנטי למשך דקה אחת ואסוף את ה-eluit לצינורות חדשים. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה לכל דגימת פליטת שבב, ו-180 מיקרוליטר של מאגר פליטה לכל דגימת קלט.

לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם לכל דגימה ומערבלו את הצינורות במרץ כדי לערבב. לאחר צנטריפוגה של הדגימות, העבירו בזהירות את השכבה המימית העליונה לצינורות המכילים 19 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט טוחנת ושני מיקרוליטרים של תמיסת גליקוגן. מערבבים על ידי מערבולת הצינורות.

הוסף 500 מיקרוליטר של 100% אתנול לכל דגימה, ומערבולת ביסודיות. הניחו את הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, או למשך הלילה כדי לזרז את הדנ"א. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות לפני השלכת הסופרנטנט, ותלייה מחדש של הגלולה במיליליטר אחד של אתנול 70%.

לאחר הסרת שאריות אתנול על ידי צנטריפוגה, יבשו את כדורי ה-DNA באוויר למשך שתיים עד שלוש דקות לפני שתשו אותם מחדש ב-400 מיקרוליטר של מאגר TE. ריכוזים גבוהים יותר של נוקלאז מיקרוקוקלי הובילו לעיכול נרחב יותר של כרומטין, וכתוצאה מכך דומיננטיות של שברי מונו-נוקלאוזום. לעומת זאת, בריכוזי נוקלאז מיקרוקוקליים נמוכים יותר, רוב שברי הכרומטין היו גדולים יותר, לעתים קרובות יותר מקילו בסיס אחד.

רמות Gamma H2 AX היו גבוהות משמעותית בתאים לחוצים בשכפול, שטופלו באתיל דקולין, בהשוואה לבקרות שטופלו ב-DMSO כפי שמוצג בדגימות הקלט הן עבור שבב מקורי והן עבור שבב צולב.