מיפוי מכני של ספרואידים באמצעות ספקטרוסקופיית ברילואין

אנו משתמשים בספקטרוסקופיית ברילואין להערכת מכניקת התאים באופן לא פולשני ולהבין את תפקיד מכנוביולוגיה בהתקדמות המחלה. טכנולוגיות לא פולשניות, כמו ספקטרוסקופיית ברילואן, מאפשרות לנו לאפיין את המכניקה בתלת-ממד, אך מבלי להפריע לדגימה. כדי להתחיל, טפלו מראש את הבארות של לוח המיקרווול על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכל באר.

צנטריפוגה את הצלחת ב-1,300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת בועות האוויר, הסר את תמיסת השטיפה נגד היצמדות מהבארות. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של PBS לכל באר ושאפו אותה במלואה.

לאחר חזרה על שטיפת PBS, קבעו את מספר התאים לכל ספרואיד ואת מספר הספרואידים לכל ג'ל בהתאם לעיצוב הניסוי. שחרר את התאים והחזיר אותם למיליליטר אחד של DMEM עם תוסף. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של תליית התא הזה לבאר אחת של פלטת המיקרווול ומערבבים היטב.

צנטריפוגה את הצלחת ב-100 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. התבוננו בלוח המיקרובאר תחת המיקרוסקופ כדי לוודא את התפלגות התאים באופן אחיד ושהם התיישבו בתחתית הבארות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות כדי לאפשר יצירת ספרואידים.

כדי לקצור את הספרואידים, להסיר בעדינות ובאיטיות את המדיה התרבותית מבלי להפריע לספרואידים. חתכו את קצה הפיפטה המצופה PBS/FBS כדי להרחיב את הפתח והוסיפו 500 מיקרוליטר PBS לכל באר כדי להוציא את הספירואידים. אסוף את ה-PBS המכיל את הספרואידים לתוך צינור.

ואז להעביר 50 מיקרוליטר של המתלים הספרואידי לבאר אחת של לוח עם 96 בארות. כדי לסייע בספירה, צייר צלב בתחתית הבאר באמצעות סמן קבוע וסופר את מספר הספרואידים בנפח זה תחת המיקרוסקופ. השתמש במשוואה כדי לחשב את מספר הספרואידים הכולל.

פתח את תוכנת SpectraLok וחכה עד שכל המכשירים המחוברים יזוהו. לאחר מכן בחר את מצלמת הספקטרומטר. התקן את קוביית האקריליק על מחזיק הדגימה של המיקרוסקופ כשהצד השקוף פונה לעדשת האובייקטיבית.

הורד את עדשת האובייקטיב כמה שיותר ומרכז את הקוביה מתחתיה. ודא שהמסלול האופטי במיקרוסקופ מוגדר כך שמצלמת הספקטרומטר תיחשף על ידי סיבוב בורר הפורט הסיבובי L.In חלון מצלמת SpectraLok, הגדר את זמן החשיפה של החיישן ל-500 מילישניות ואת רווח התוכנה ל-100. לחץ על Capture, והזיז לאט את עדשת האובייקטיב כלפי מעלה.

המשך להרים את העדשה עד שפסגות ברילואן נראות ועוצמתן מתייצבת, מה שמעיד שהנקודה המוקדית ממוקמת בתוך קוביית האקריליק. עכשיו, פתח את חלון השליטה של Pump Killer, או PK. התקרב לאחת מהפקודות הבהירות ביותר של ברילואין והתמקם במיקום מפעיל הלחץ במרווחים של 100 מיקרומטר על ידי לחיצה על move rel כדי למזער את עוצמת השיא של Rayleigh.

אם אות Rayleigh עולה, לחץ על Reverse כדי לשנות את כיוון ההתאמה. כאשר עוצמת השיא של ריילי יורדת, כוונו את לחץ האטלון בקטעים קטנים יותר של 10 מיקרומטר. בחלון המצלמה, התקרב לאחת מהזמנות ברילואן.

לחץ על S כדי להמחיש פסים שעליהם מופעל ה-LUT על תמונת המצלמה. פתח את חלון ההגדרות, ולחץ על כיול מהיר כדי לחשב אוטומטית מחדש את ההזזה האופקית האופקית האופטימלית של הפסים. לאחר אימות יישור הפסים, כוון את צירי עדשת הקולימטור כדי למקסם את יעילות הקישור של האור מה-Pump Killer לספקטרומטר.

לאחר מכן פתחו את חלון הספקטרום ולחצו על Unwrap כדי לשלוף את הספקטרום. בקוביית אקריליק הומוגנית, יש לכוון לדיכוי מוחלט של אות ריילי ולכוון עד שאות ברילואן יהיה נראה בבירור. כדי לשמור את הפרמטרים האופטימליים, לחץ על רענון הכל, ואז שמור הכל בחלון הבקרה של PK.

לבסוף, בחלון הראשי, לחץ על Save בחלק File I/O כדי לאחסן את התצורה. לאחר פתיחת תוכנת הסריקה, התקן את צלחת פטרי עם תחתית זכוכית המכילה את דגימת ההידרוג'ל הספרואיד במקום קוביית האקריליק. הסר את מכסה צלחת פטרי, הוסיף מספיק חומר לטבילה של הג'ל, והנח כיסוי מעל כדי למנוע תנועת הג'ל.

אתר את הספרואיד על ידי חסימת קרן הלייזר תחילה. החלף את המסלול האופטי של המיקרוסקופ לעינית והדלק את האור הלבן. באמצעות הג'ויסטיק, שלוט ידנית בשלב הדגימה כדי לאתר ולהתמקד בספרואיד.

רכוש תמונת שדה בהיר של הספרואיד וכיוון את בהירות התאורה על ידי סיבוב גלגל הבקרה. החלף את המסלול האופטי ל-R כדי לחשוף את מצלמת המיקרוסקופ וקבע את זמן החשיפה לפי הצורך. לאחר מכן, כוון את יציאת המיקרוסקופ ל-L וצלם את הרקע כשהלייזר עדיין חסום.

שחרר את הלייזר, ובהתאם ליחס האות לרעש הרצוי, בחר זמן חשיפה בין 200 ל-500 מילישניות. מתוך הספקטרום הלא עטוף, בחר את טווח התאמת השיא של ברילואן. כוונן את ערך הסף לכמחצית מעוצמת השיא של ברילואן, והוציא פסגות ברילואן עם עוצמה מתחת לסף.

יישם תיקון אורך גל על הלייזר בהתאם לכל זוגות שיאי ברילואן שזוהו. לבסוף, בחר את גיאומטריית הסריקה הרסטרית על ידי התאמת רוחב הסריקה וגודל הצעד, והתחל את הסריקה כדי לרשום את המדידות. תמונות מייצגות של ספרואיד תאי גזע מזנכימלי המוטמע בהידרוג'ל הציגו מפות מובחנות של הזזת ברילואין ומפות רוחב קו ברילואין, יחד עם תמונות פלואורסצנציה מתאימות של שדות בהירים, גרעינים וחוטי אקטין.

מפת השינוי בתדר ברילואין ברזולוציה נמוכה חולקה לאזורי ג'ל וספירואיד, בהתבסס על הקונטור שנעקב ידנית מתמונת השדה הבהיר. פיקסלים עמומים שנוצרו מדגימה קטנה הוצאו מהניתוח, בעוד שנוצרו מסכות בינאריות ברורות לאזורי הג'ל והספרואיד כדי להפיק ערכי BFS. השוואה בין מפות BFS ברזולוציה גבוהה ונמוכה הראתה כי דגימת הליבה סיפקה ערכי BFS ממוצעים הדומים לסריקות ברזולוציה גבוהה, מה שמעיד על מדידה עקבית של מכניקת נפח ספרואיד.

הפרוטוקול שלנו יספק פלטפורמה שתאפשר לחוקרים לחקור מחלות רבות הקשורות למכנוביולוגיה. יהיה מעניין לראות אם שינויים בהזזת ברילואין הקשורים לתכונות מכניות של התא הם סמנים יעילים לשלבים של התקדמות המחלה. נבחן כיצד טיפולים תרופתיים משפיעים על מכניקת הספרואיד לאורך טווחי זמן המדמים התקדמות המחלה.