בידוד של תאי סטרומה מזנכימלייםשמקורםבחבל הטבור גבוה BAMBI גבוה MFGE8

התחום שלנו הוא לבודד תת-קבוצות ספציפיות של UC-MSCs אנושיים ולנתח את המאפיינים הבסיסיים שלהם בהתאם לגורמים הטרנסקריפטומיים של התא הבודד שלהם. אנו מנסים לענות על המאפיינים והפונקציות הייחודיים עבור תת-אוכלוסיות שונות של UC-MSC. ההתפתחויות האחרונות בתחום שלנו הן גילוי ההטרוגניות של אוכלוסיות MSC מעורבות, בעיקר באמצעות ריצוף RNA של תא בודד.

זיהינו את שלוש תת-האוכלוסיות בתוך UC-MSCs אנושיים, כולל תאים גבוהים של BAMBI MFGE8. תת-קבוצה זו מציגה פנוטיפ מובהק, פרופיל טרנסקריפטומי ייחודי, פוטנציאל אדיפוגני מוגבל ופעילות מדכאת חיסון מופחתת בדלקת כליות זאבת. ממצאים אלה מקדמים את ההבנה של UC-MSCs ותומכים בבחירת תת-קבוצות אופטימליות לטיפול במחלות ספציפיות.

אנו סוללים את הדרך להבנת הפונקציות האמיתיות לא רק של BAMBI גבוה MFGE8 UC-MSCs אלא גם של שתי תת-הקבוצות האחרות, במיוחד תפקידיהם בטיפול במחלות שונות. אנו נמשיך להתמקד בהתחלת יישומים של תת-קבוצות UC-MSC אנושיות על מחלות מרובות המתווכות על ידי מערכת החיסון ולחקור את המנגנונים המולקולריים שלהן בטיפול במחלות אלה. כדי לבודד BAMBI גבוה MFGE8 UC-MSCs גבוה, תרבית UC-MSC לצפיפות של כ-5 עד 10 פעמים 10 בחזקת 6 תאים ב-DMEM מלא.

הוסף 0.5 מילי-מולרי EDTA למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, הוסף את ה-DMEM השלם והעביר את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. פיפטה את מתלה התא למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להכין מתלה חד-תא.

קח 10 מיקרוליטר ממתלה התאים. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, וחשבו את המספר הכולל של התאים שנקצרו. לאחר הספירה, צנטריפוגה את מספר התאים הנדרש ב -300 גרם למשך חמש דקות.

השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום שלם כדי להשיג ריכוז של 5 עד 10 פעמים 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר, והניחו את הצינור על קרח. לאחר מכן, חלקו את התאים שנקטפו לארבעה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף את הנוגדנים העיקריים בדילול של 1 עד 100 לצינורות MFGE8 ו-BAMBI.

מערבבים היטב את התוכן ומדגרים את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הוסף PBS כדי לשטוף את התאים המסומנים. צנטריפוגה את הצינורות ב-300 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט לפני השעיית הגלולה במיליליטר אחד של מדיום שלם.

הוסף את הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים המצומדים בדילול של 1 עד 1,000 לתאים המרחפים. מערבבים היטב ומדגרים את הצינורות בטמפרטורת החדר בחושך ארבע 15 דקות. לאחר הדגירה, הוסף PBS וצנטריפוגה כדי לשטוף את התאים המסומנים

השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום שלם וסננו אותם דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר גושים ופסולת. העבירו את המסנן לצינור של 15 מיליליטר למיון זרימה ציטומטרית. הפעל את צינור התא הריק כבקרה שלילית מבלי להוסיף נוגדן.

התאם את הגדרות הפיזור קדימה ופיזור הצד על ציטומטר הזרימה כדי לקבוע את סולם השער עבור האוכלוסייה הלא מוכתמת. לאחר מכן, הפעל את MFGE8 ו-BAMBI המסומנים על ידי נוגדן יחיד כבקרת שער כדי לקבוע היכן מתחילה החיוביות בעלילה. הפעל את צינורות הדגימה הניסיוניים כדי למיין את אוכלוסיית התאים הגבוהה של BAMBI MFEG8 ולאסוף את התאים הממוינים.

צלחו את ה-MSCs הממוינים בצלחת של 24 בארות ודגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שהתאים הממוינים גדלו דרך שני מעברים, בצע ניתוח ציטומטריית זרימה כדי לאשר את טוהר האוכלוסייה הממוינת. UC-MSCs מתורבתים היו חיוביים מאוד לביטוי CD44, CD73, CD90 ו-CD105, ושליליים לביטוי CD14, CD34, CD45, CD79 ו-HLA DR.

MSCs גבוהים של BAMBI MFEG8 גבוהים מוינו מ-UC-MSCs אנושיים מתורבתים, ורמות הביטוי הגבוהות שלהם BAMBI ו-MFEG8 אושרו להימשך לאורך שלושה עד ארבעה מעברים. השכיחות של MSCs גבוהים MFEG8 גבוהים של BAMBI השתנתה בהתאם לשיטת התורם והדיסוציאציה.