שיטה יעילה להדמיית ריאות עכברים המשמרת דינמיקה מרחבית של נבגי פטריות בדרכי הנשימה
13 בדצמבר 2024
אנו מציגים שיטה למודל פתוגנזה פטרייתית המשמרת את המיקום הטבעי של נבגי פטריות בדרכי הנשימה של הריאות לניתוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
מחקר זה נועד לבסס פרוטוקול יעיל לשימור תכולת דרכי הנשימה של עכברים במודלים של זיהום ריאות. אנו מפתחים את היכולת לענות על השאלה היכן נוחתים נבגי פטריות שנשאפים בריאות. לאחרונה, קבוצות רבות זיהו תפקידים לתאי אפיתל שונים בדרכי הנשימה בחישת זיהומים וייזום תגובות חיסוניות מגנות.
תאי אפיתל אלה נעים בין תאי מועדון בסימפונות לתאי אפיתל מסוג II בנאדיות הסופיות. טכניקת הכנת הריאות הנפוצה היא לנפח את הריאה עם הקיבוע הנוזלי כדי לשמר את רקמת הריאה לניתוחים היסטולוגיים במורד הזרם. עם זאת, טכניקה זו עוקרת תוכן של דרכי הנשימה, כגון נבגי פטריות שנשאפו.
הפרוטוקול שלנו משמר את המיקום הטבעי של נבגי הפטרייה הנשאפים בריאה תוך שמירה על מורפולוגיה ריאתית תקינה באמצעות ניפוח אוויר וקיבוע ריאות תקין באמצעות זלוף כלי דם. אנו מקווים להשתמש בפרוטוקול זה כדי לאפיין את הצמתים הברונכואלבאולרים שבהם נראה שהנבגים נוחתים במודל שלנו, אך נשתמש במיקומי הנבגים בקרבת תאי אפיתל שונים ונחקור את התגובות החיסוניות המתקבלות. כדי להתחיל, יש לצבוע פעם אחת פי 10 בעוצמה של שישה נבגי Coccidioides posadasii עם ריכוז של חמישה מיקרו-מולרים של CFSE למשך 30 דקות ב-30 מעלות צלזיוס.
לאחר הצביעה יש לשטוף את הנבגים עם PBS. צנטריפוגה של הנבגים ב-12,000 גרם והשעתה את הגלולה ב-25 מיקרוליטר PBS לחיסון נבגים בריכוז המתאים. הכן פיפטה עם 25 מיקרוליטר של חיסון הנבגים.
לאחר הרדמת העכבר בצנצנת Nalgene, מקם את העכבר במצב שכיבה ביד אחת ואפשר לו לקחת שלוש עד חמש נשימות מתנשפות רגילות. הנח את קצה הפיפטה בחלק האחורי של אורו-לוע העכבר ושחרר את החיסון במהלך השאיפה. הרגישו פצפוצים בהיבטים האחוריים והקדמיים של בית החזה של העכבר עם היד והאגודל כדי לאשר שאיפת החיסון.
רססו את העכבר המורדם עמוק באתנול 70%. בעזרת מספריים, חותכים בזהירות את עור העכבר, ואז מפרקים אותו כדי לחשוף את הצפק. לאחר מכן, משוך את העור מהחצי העליון מעל ראשו של העכבר, ושחרר את הזרועות.
כעת, חותכים את קרום הצפק בעצם החזה ולאורך ההיבט התחתון של כלוב הצלעות, חושפים את הצפק. עקור את הכבד בצורה נחותה כדי לחשוף את הסרעפת. השתמש במספריים כדי לנקב בזהירות את הסרעפת הרחק מפרנכימת הריאות.
לאחר מכן, חתוך את כלוב הצלעות בצד שמאל כדי לחשוף את הלב. בעזרת מחט בגודל 30, הזרקו חמישה עד 10 מיליליטר PBS לחדר הימני. לאחר הסרת המחט, השתמש במחט חדשה כדי להזריק חמישה מיליליטר של פורמלין ניטרלי 10% לחדר הימני.
בעזרת מספריים, הסר את החצי הקדמי של כלוב הצלעות. כדי לחשוף את קנה הנשימה, חותכים את הצלעות העליונות ועצמות הבריח מימין ומשמאל לצוואר, והימנעו מקו האמצע שבו שוכב קנה הנשימה. בעזרת מלקחיים, אחזו את הצלעות העליונות ועצמות הבריח הנותרות ליד קו האמצע של הצוואר ומשכו בעליונות עד לחשיפת קנה הנשימה.
הכן חוט תפר של 10 סנטימטר ומשוך אותו מתחת לקנה הנשימה. קשרו מראש קשר רופף בקצה התחתון של קנה הנשימה החשוף. לאחר מכן, הכינו מזרק אוויר של מיליליטר אחד עם קטטר בגודל 18.
בעזרת מחט בגודל 18, צור חור בקנה הנשימה בקצה העליון של האזור החשוף. כעת, הכנס את הקטטר לתוך החור, והבטיח התאמה הדוקה כדי למנוע בריחת אוויר. לאחר מכן, הזריק לאט מיליליטר אחד של אוויר לריאות במשך 10 שניות, תוך צפייה בהתנפחות של כל אונות הריאה.
ניפוח מלא מביא לכך שהריאות עוטפות מעט את הלב וממלאות את הנפח התפוס בסרעפת הלא מנוקבת. לאחר בידוד הריאות מהעכבר, הנח אותו על הקצה העליון של צינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא ב-20 מיליליטר של פורמלין ניטרלי 10%. הנח את חוטי התפרים מחוץ לצינור, ולאחר מכן הברג את המכסה.
כדי להתחיל, שטפו את ריאות העכבר המבודדות ב-PBS, והניחו אותן בתמיסת PBS של 30% סוכרוז למשך 72 עד 96 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר רקמות עודפות והנח את הריאות ב-Cryomold עם מדיום OCT. הקפיאו את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס.
אזנו את הדגימה בבלוקים קריולוגיים OCT במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני חלוקת הבלוקים בעובי של 20 עד 100 מיקרומטר. אספו חלקים על מגלשת זכוכית והניחו להם להתייבש במשך 30 דקות עד שעה. יש להניח את השקופית באמבט PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להסיר OCT מהרקמה.
לאחר מכן, השתמש במגבון כדי להסיר טיפות עודפות מהיקף המגלשה סביב דגימת הרקמה. צייר היקף סביב הדגימה על השקופית בעזרת עט PAP הידרופובי והניח לו להתייבש במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה טרייה ללא בעלי חיים על המגלשה ודגרו בטמפרטורת החדר.
כעת, דגרו את המגלשה ב-300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים EpCAM מצומדת נגד עכברים של Alexa Fluor 647 במהלך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את השקופית פעמיים עם 300 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות. לאחר הייבוש, הוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה מזכוכית SlowFade רך בטמפרטורת החדר לכל פיסת רקמה.
הנח כיסוי מעל הרקמה, וודא שהיא משתרעת מעבר לדגימה ולהיקף הסמן ההידרופובי. כדי להתחיל, הנח את קטע ריאות העכבר המחוסן בנבגים פטרייתיים מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-ערוצי ובחר מטרה מתאימה. כדי ללכוד את כל אונת הריאה, אסוף מספיק אריחי תמונה ומזג אותם יחד.
באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, ייצא את התמונה של כל אונת הריאה לעיבוד במורד הזרם. ב-QuPath, צרו קובץ פרויקט והוסיפו את התמונות הפלואורסצנטיות לקובץ. סווג את הפיקסלים החיוביים ל-EpCAM כאפיתל על-ידי בחירה רציפה בסיווג, סיווג פיקסלים וצור סף.
בחר את הרזולוציה, הערוץ, סיגמת ההחלקה וערך הסף כדי לזהות את אזור היעד. שמור את המסווג תחת שם ייחודי ובחר צור אובייקטים. בחלון החדש יצירת אובייקטים, בחר סוג אובייקט חדש כביאור.
עבור אפיתל ריאות, הגדר את גודל האובייקט המינימלי ואת גודל החור המינימלי ל-100 מיקרומטר רבוע. לאחר בחירת OK, הביאורים ייווצרו וניתן לשנות אותם באמצעות כלי המברשת. כדי לסווג נבגים, חזור על השלבים כפי שהודגם עבור הערות אפיתל הריאה.
לאחר מכן, בחלון יצירת אובייקטים, בחר זיהוי כסוג האובייקט החדש. הגדר את גודל האובייקט המינימלי ואת גודל החור המינימלי לאפס מיקרומטר רבוע ובחר Split objects. לאחר מכן, כדי לבצע ניתוח מרחבי של הנבגים ברצף, בחר ניתוח, ניתוח מרחבי וחשב מרחק חתום לביאורים דו מימדיים.
המרחקים לאפיתל חיובי ל-EpCAM יחושבו עבור כל נבג שזוהה. לבסוף, לחץ על מדידה ולאחר מכן על ייצוא מדידות כדי לייצא את התוצאות. נבגים של Coccidioides posadasii הצטברו בעיקר בסימפונות הדיסטליים ובחללים המכתשית הסמוכים בריאות המנופחות באוויר.
נבגים נראו מפוזרים יותר מהסימפונות בריאות רשמיות ומנופחות בנוזל בהשוואה לריאות מנופחות באוויר. המרחק בין נבגים לאפיתל הסימפונות החיובי ל-EpCAM היה גדול יותר בריאות מנופחות בנוזל בהשוואה לניפוח אוויר פיזיולוגי, מה שמעיד על נבגים מפוזרים יותר.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה למודל של פתוגנזה פטרייתית השומרת על המיקום הטבעי של נבגי הפטריות בדרכי הנשימה בריאות. גישה זו מאפשרת ניתוח מפורט באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ובכך משפרת את הבנתנו לגבי זיהומים פטרייתיים בריאות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצב
- מיקרוביולוגיה
- פתוגנזה
רקע
- הבנת תפקידם של תאי אפיתל דרכי הנשימה בזיהוי זיהומים.
- חשיבותם של שימור תכני דרכי הנשימה במודלים של זיהומי ריאות.
- טכניקות נפוצות המשמשות להכנת ריאות ומגבלותיהן.
- הצורך בשיטות משופרות למחקרי נבגי פטריות שנשאפו.
מטרת המחקר
- לבסס פרוטוקול יעיל עבור מודלים של זיהום ריאות.
- לקבוע את אתרי הנחיתה של נבגי פטריות שנשאפו לתוך הריאות.
- לשפר את הניתוח של תכני דרכי הנשימה במהלך זיהומים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של מודל פתוגנזה פטרייתית.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך אנליזה.
- שימור של תוכן דרכי הנשימה ללא הזזה.
- השוואה לטכניקות מסורתיות להכנת ריאות.
תוצאות עיקריות
- שימור מוצלח של נבגי פטריות במיקומם הטבעי.
- שיפור הוויזואליזציה של תכני דרכי הנשימה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- זיהוי אזורי מפתח שבהם הנבגים נוחתים בריאות.
- הבנה משופרת של האינטראקציה בין נבגים לתאי אפיתל.
מסקנות
- השיטה החדשה מאפשרת ניתוח מדויק של פתוגניות פטרייתית.
- שימור תכני דרכי הנשימה הוא קריטי לחקר זיהומים בריאות.
- גישה זו יכולה להוביל לתובנות טובות יותר לגבי תגובות חיסוניות בריאות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שימור הדינמיקה המרחבית של נבגי פטריות שנשאפו לריאות עכברים מאפשר מיפוי ברמת דיוק גבוהה של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן בממשק דרכי הנשימה. שיטה זו נותנת מענה לפער קריטי במודלים של זיהומים בדרכי הנשימה על ידי שמירה על לוקליזציה פיזיולוגית, דבר התומך בהסרת סיכונים מנגנונית ובביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי. גישה זו משפרת את הרציפות התרגומית למחקר של מחלות נשימה ואת תעדוף הפורטפוליו בקווי פיתוח של מחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מערכות יחסים מרחביות בין מארח לפתוגן בצומת הברונכואלוולארי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של תפקידי תאי אפיתל דרכי הנשימה בזיהוי חיסוני.
- משפר את הביטחון החזוי עבור מחקרים מכניסטיים המשכיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי שימור מיקרו-סביבות זיהום טבעיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מודלים מאושרים של רקמת ריאה עבור בדיקות כמותיות מבוססות דימות.
- מסטנדרט את הכנת הדגימות כדי להבטיח הדירות של נתוני פיזור מרחבי.
- מאפשר ניתוח חישובי בתפוקה גבוהה באמצעות תוכנת QuPath בקוד פתוח.
- תומך בהערכה מהימנה של התערבויות אנטי-פטרייתיות בהקשרים רלוונטיים פיזיולוגית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים של זיהום פרה-קליני לדינמיקה מרחבית רלוונטית למחלה.
- מאפשרת הערכה של תגובות חיסוניות במיקומים מדויקים בדרכי הנשימה.
- תומכת בקידום מותאם סיכונים של טיפולים נשימתיים המכוונים לממשקים בין המאכסן לפתוגן.
- מסייעת בגילוי סממנים ביולוגיים הקשורים למיקום מרחבי של הזיהום.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה חסונה לניתוח מרחבי של זיהום במודלים של עכברים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מיקום נבגים ואינטראקציות של תאי אפיתליום.
- סריקה: מספק תוצרי דימות כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה מרחבית והשוואה סטטיסטית של התפלגויות נבגים באמצעות QuPath.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי הגילוי לאימות פרה-קליני במערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה למספר מודלים של זיהומים פטרייתיים בדרכי הנשימה וניתן להרחבה למחקרים בעבודת סריקה רחבה (high-throughput).
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במודלים של זיהום.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי הכנת הריאות והדימיון לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) באמצעות אספקת נתוני זיהום רלוונטיים פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של יעדים והתערבויות בזיהומים נשימתיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח ריאות עכבר, פרפוזיה ושימור בהקפאה (cryopreservation).
- נדרש גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-ערוצית ותשתית לניתוח תמונות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בדגימות ופרוטוקולי דימוי.
- ניתן להתאמה למגוון פתוגנים פטרייתיים ומודלים של זיהומים נשימתיים.
- תלוי במיומנות חישובית לביצוע ניתוח מרחבי בעתק גבוה ב-QuPath.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:28
Labeling and Inoculation of Fungal Spores in Mice with Lung Perfusion and Inflation for Respiratory Studies
4:56
Cryosectioning and Immunostaining of Lung Tissues from Mice Inoculated with Fungal Spores for Detection of Airway Epithelial Markers
7:18
Fluorescent Microscopy and Spatial Analysis of Lung Sections for Airway Epithelial Marker and Spore Detection
9:28
Representative Results
