בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

המחקר שלנו מתמקד באפיון השלפוחיות החוץ-תאיות של Echinococcus granulosus ותפקידן באינטראקציות בין טפילים למארח. אנו חוקרים את ספיגת ההרכב על ידי תאים דנדריטיים מארחים ואת ההשפעה הפוטנציאלית על אימונומודולציה. הראינו כי E. granulosus EV נקלטים על ידי תאים דנדריטיים, ומשפיעים על ההתבגרות והצגת האנטיגן. אנו גם מזהים חלבונים אימונומודולטוריים ואנטיגניים מרכזיים במטען EV, שעשויים להשפיע על אינטראקציות טפיל-מארח ותגובות חיסוניות.

הפרוטוקול שלנו מייעל תרבית טפילים במבחנה לייצור EV קטן משופר ומבטיח בידוד באיכות גבוהה ומשלב בדיקות תאים דנדריטיים לחקר אימונומודולציה. ניתן ליישם אותו בשלמותו או בחלקים. המחקר העתידי שלנו יחקור את ההשפעות in vivo של E. granulosus EVs על תגובות חיסוניות, הפוטנציאל שלהם כמרכיבי חיסון, והשפעתם על תאים דנדריטיים, מיקרופאג'ים והמודלים החיסוניים של תאים אלה.

[קריין] כדי להתחיל, נקו את פני הגחון של העכבר שהומת עם מחלת הידטיד באמצעות 70% אלכוהול. פתח בניתוח את חלל הצפק כדי להסיר את המטצטודות המפותחות באמצעות מספריים ומלקחיים. לאחר מכן, העבירו את מסות המטצטודה לצלחת פטרי סטרילית באמצעות מלקחיים. הסר את רקמת החיבור באמצעות מלקחיים, במידת הצורך, כדי לשחרר את הציסטות מהמוני המטצסטודה. שטפו את המטצטודות שהתקבלו בתוספת PBS בארבע מעלות צלזיוס. כעת, הכינו את מדיום התרבות באמצעות כל הרכיבים הנדרשים, וערבבו את התמיסה בעדינות על ידי היפוך. העבירו חמישה מיליליטר ממדיום התרבות המוכן לכל צינור לייטון. הוסיפו את הטפילים למדיום התרבות ודגרו על הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים מבלי לשנות את המדיום. אסוף את מדיום תרבית הטפילים מכל צינור לייטון והעביר אותו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של המדיום שנאסף ב-300 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס והעבירה את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. כעת, צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-2,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט שנוצר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה. צנטריפוגה של הצינור ב-10,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים קטנה יותר. בעזרת פיפטה, העבירו את הסופרנטנט לצינור המתאים לרוטור האולטרה-צנטריפוגה. סמן צד אחד של הצינור בטוש. והנח את הצינור ברוטור כשהצד המסומן פונה כלפי מעלה. צנטריפוגה של הצינורות ב-100,000 גרם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. יש לשפוך את ה-supernatant במהירות ולהניח לשפופרת לנוח הפוך למשך דקה אחת. שטפו את הגלולה עם לפחות שלושה מיליליטר PBS כדי להסיר את החלבונים המזהמים. השעו מחדש את הגלולה מספר פעמים באמצעות פיפטה לאורך כל פני הצינור, תוך התמקדות בצד המסומן שבו הגלולה צפויה להיות. לאחר חזרה על האולטרה-צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר PBS. העבירו את הדגימה המושהה לצינור של 1.5 מיליליטר והקפיאו את השלפוחיות החוץ-תאיות במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון. רססו את נקבת עכבר CF-1 בת חמישה עד שמונה שבועות שהורדמה באתנול לפני הכנסתו למכסה המנוע. הנח את העכבר על לוח חיתוך במצב שכיבה. בעזרת מלקחיים ומספריים מנתחים מבצעים חתך T אנכי מעל השופכה ומרחיבים אותו אופקית לחלק העליון של הגפיים התחתונות. בעזרת מלקחיים יש להפריד את העור לאורך שתי הגפיים האחוריות כדי לחשוף את עצמות הרגליים והרקמות. בעזרת הידיים, הסר את העור של כל רגל לאחר דחיפה מהקרסול לכיוון הבטן, משיכת העור לצד הנגדי, והשארת שתי הרגליים נקיות מעור. כעת, הסר בזהירות את עצם הירך והשוקה באמצעות מספריים ומלקחיים, והבטיח שלא תהיה שבירה. מהדקים את קצה כל עצם בעזרת מלקחיים. וחתכו את הגידים כדי להסיר את פאסיות השרירים סביב העצמות. ניקוי מלא של רקמת השריר במפיות נייר. הנח כל עצם שהוסרה לתוך צינור סטרילי של 50 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של מדיום RPMI מלא בתוספת כדי להסיר פסולת. לאחר השלכת המדיום, שטפו את העצמות פעמיים עם אתנול 70% למשך חמש דקות בכל פעם. העבירו את העצמות השטופות לצלחת פטרי סטרילית וחתכו את האפיפיזות של שתי העצמות באמצעות מספריים חדים כדי לגשת לתאי מח העצם. בעזרת מחט בקוטר 25 המחוברת למזרק של 20 מיליליטר המכיל מדיום שלם, שטפו בזהירות את תאי מח העצם מכל אחת מארבע העצמות לצלחת פטרי סטרילית. לאחר מכן, הומוגניזציה עדינה של המדיום המכיל מח עצם חמקמק על ידי פיפטינג להסרת רקמת חיבור עצם וגושי תאים. העבירו את הדגימה לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר, והעבירו את התאים דרך מסננת תאי פוליפרופילן סטרילית של 70 מיקרומטר כדי להסיר רקמת חיבור ופסולת עצם. צנטריפוגה של התאים ב-450 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר והשליך בזהירות את הסופרנטנט, וודא שהגלולה נשארת דבוקה לדופן הצינור. לאחר דגירה של התאים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, יש להשעות אותם מחדש ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה RBC ולנטרל את מאגר הליזיס עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם. צנטריפוגה של התאים ב-450 גרם למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום שלם. לאחר סינון הדגימה כפי שהודגם, ספור את התאים באמצעות המוציטומטר. הוסף 300 ננוגרם למיליליטר של טירוזין קינאז הקשור לעכברים רקומביננטיים FMS, או FLT3L, למדיום התרבית. צלחת את התאים בצלחת מרובת בארות בריכוז של אחד כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר. דגרו על התאים במשך שבעה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השלישי, הסר מיליליטר אחד של מדיום מכל באר מבלי להפריע לתאים, והחלף אותו במיליליטר אחד של מדיום שלם טרי שחומם מראש, בתוספת 150 ננוגרם למיליליטר של עכברים רקומביננטיים FLT3L. השלפוחיות החוץ-תאיות, או EVs, שטוהרו משלב הזחל של Echinococcus granulosus היו בעיקר EVs קטנים בגדלים שנעו בין 50 ל-200 ננומטר, שאושרו על ידי פיזור אור דינמי ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור. תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם הדגימו התמיינות מורפולוגית במשך שבעה ימים, והתקדמו מתאים המטופויאטיים קטנים ועגולים לתאים בצורת כוכב עם הרחבות ציטופלזמיות. לאחר שעה אחת של דגירה, התאים הדנדריטים לכדו EVs קטנים עם תווית פלואורסצנטית, אשר התמקמו יחד עם מולקולות MHCIII בתאים אנדוזומיים-ליזוזומליים, כפי שאושר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.