השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

ביו-הנדסה של איברים בגודל אנושי דורשת כמות גדולה של משאבים, שלעתים קרובות עולה על הקיבולת של מעבדות אקדמיות. הפחתת העלות של פיתוח פרוטוקול איטרטיבי תאיץ את התקדמות המחקר בתחום זה. מטרת מחקר זה היא לספק את הפרוטוקול הסטנדרטי לביו-הנדסה ריאתית באמצעות בלוקים של לב-ריאה של עכברים. עדיין לא ידוע אילו תאים מתאימים להנדסה ביולוגית של איברים, וכיצד יש לשלב תאים אלה בתרבית הביוריאקטור של האיברים. יש להשוות סוגים מרובים של תאים ותנאים על מנת ליצור פרוטוקולים ניתנים להרחבה ולשחזור.

עכברים הם חיות ניסוי קטנות וקלות לטיפול. עם זאת, למרות שהם קטנים, הארכיטקטורה הבסיסית של הריאה דומה בין יונקים. על ידי אופטימיזציה של הפרוטוקול בפלטפורמה הקטנה הזו, אנו יכולים להגדיל את המודלים של חיות הלייזר פשוט על ידי הכפלת התוצאות האופטימליות בהתאם לגודל החיות. פלטפורמת ביו-הנדסת ריאות בגודל עכבר מאפשרת לחוקרים לבדוק את תאי הגזע שלהם ביעילות. תאים מהונדסים גנטית אלה יכולים להיות יקרים או יקרים לשימוש עבור הנדסת הריאות כולה. בנוסף, ניתן להשתמש בתאים שמקורם בחולה גם ליצירת מודלים של מחלות במבחנה.

המאמצים הנוכחיים כוללים בדיקת סוגים מרובים של תאי גזע ותאי אב מהונדסים, כדי להבין את פוטנציאל ההתפשטות הנדרש ואת היכולת הדיפרנציאלית לביו-הנדסה ריאתית. לאחר זיהוי תאים מתאימים, מחקר זה יורחב למודל בעל חיים גדול יותר כמו חזירים.

[קריין] כדי להתחיל, הניחו את העכבר המומת בשכיבה על שולחן ניתוחים, וקבעו את הגפיים. רססו 70% אתנול באופן שווה על החזה ומשטח הבטן כדי לעקר אותו. לאחר מכן, פתח את חלל הבטן לאורך הקו החציוני המשתרע עד הצוואר, בעזרת מספריים אל חלד, ופצל את עצם החזה. כריתה את הסרעפת מדופן בית החזה. חותכים את דופן בית החזה הגחוני כדי לחשוף את חללי בית החזה ולהסיר את בלוטת התימוס. בעזרת תפר משי 4/0, השליכו את הווריד הנבוב התחתון ואת הווריד הנבוב העליון הימני. חותכים את אבי העורקים הבטני במספריים אל חלד לניקוז. בעזרת מזרק סטרילי של חמישה מיליליטר המצויד במחט בגודל 27, הזריק שלושה מיליליטר PBS סטרילי לחדר הימני על ידי ניקוב דופן החדר. השתמש במלקחיים של Dumont כדי לולאת תפר משי 4/0 סביב עורק הריאה הראשי. לאחר מכן, חותכים חלון של שני מילימטר מתחת לשסתומי עורק הריאה, בעזרת מספריים קפיציים, כדי לגשת לדופן החדר הימני. הכנס את קטטר עורק הריאה דרך החלון, ואבטח אותו עם תפר המשי 4/0 בלולאה מראש. הזריק לאט שני מיליליטר PBS דרך קטטר עורק הריאה, באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר. קנו את קנה הנשימה עם קטטר קנה הנשימה, וקשרו אותו למקומו עם תפר משי 4/0. כעת, הזרקו לאט שני מיליליטר אוויר דרך צנתר קנה הנשימה באמצעות מזרק ריק של חמישה מיליליטר. החזק את האוויר למשך 10 שניות כדי להבטיח שלא תהיה דליפת אוויר מהריאות. הסר את בלוק הקצה של הלב והריאות. לאחר מכן, העבירו את גוש הלב-ריאה שנכרת לצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 10 סנטימטרים המכילה מים נטולי יונים, לצורך דה-סלולריזציה של הריאות. דגרו את הבלוק למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר, יש להזריק שני מיליליטר מים סטריליים נטולי יונים דרך צנתר קנה הנשימה שלוש פעמים. עצור לאחר כל הזרקה כדי לאפשר לנוזל לצאת כשהריאות נרתעות. באופן דומה, הזריק שני מיליליטר מים דרך קטטר עורק הריאה. הזרקו שני מיליליטר של תמיסת טריטון X-100 0.1% לצנתרי קנה הנשימה ועורק הריאה. העבירו את גוש הלב-ריאה לצלחת פטרי, ודגרו באופן סטטי בתמיסת טריטון X-100 למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, כדי להוציא את תמיסת Triton X-100 מהריאות, הזרקו שני מיליליטר מים נטולי יונים לצנתר קנה הנשימה ולקטטר עורק הריאה, וחזרו על אלה עם שני מיליליטר של תמיסת דאוקסיכולט 2%. לאחר הוצאת תמיסת הדאוקסיכולט מהריאות, יש להזריק שני מיליליטר של תמיסת נתרן כלוריד מולרית אחת לצנתרי קנה הנשימה ועורק הריאה. דגרו על גוש הלב-ריאה למשך שעה. לאחר הסרת תמיסת הנתרן הכלורי במים נטולי יונים, הזרקו שני מיליליטר של תמיסת עבודה DNase I לצנתרי קנה הנשימה ועורק הריאה. דגרו על גוש הלב-ריאה למשך שעה. הזריק PBS סטרילי לצנתרי קנה הנשימה ועורק הריאה כדי להסיר את תמיסת ה-DNase I. לאחר דה-סלולריזציה, ודא שהריאות לבנות ושקופות בקצוות. הוסף 70 מיליליטר של מדיום גידול תאי אנדותל 2, או אמצעי תרבית EGM-2, למיכל הזכוכית, והנח את פקק הסיליקון על גבי המיכל כדי לאטום אותו. הרכיבו פקק סיליקון, מיכל זכוכית, מכסה בורג GL45 עם צינורות, בקבוק זכוכית הניתן לחיטוי בנפח 250 מיליליטר וצינורות L/S 14 עם אביזרי פיתוי באמצעות פקקי עצירה תלת-כיווניים. הכנס מחט בגודל 20 לתוך מחיצת הסיליקון של מכסה הבורג GL45. מלאו את צינורות A, B ו-C באמצעי תרבית באמצעות מזרק של 10 מיליליטר המחובר לפקקים 1 ו-3. חבר את קטטר עורק הריאה של גוש הלב-ריאה המנותק לצינור C באמצעות התאמת פיתיון. ודא שאין בועות אוויר בצנתר או בצינור. להזרקה מונעת כוח הכבידה של תאי אנדותל, הנח מאגר תאים המכיל תאי אנדותל וריד טבורי אנושי, או HUVECs, על מערבל מגנטי, וודא שהמאגר נמצא 30 סנטימטרים מעל תא האיברים. הפעל את המערבל המגנטי במהירות של 120 סל"ד. פקקי עצירה פתוחים 1 ו-2 כדי לאפשר לתרחיף התא לזרום לתוך הפיגום המנותק, דרך צינור A, צינור C וצנתר עורק הריאה. לצורך זילוף תרבית איברים, הנח את תא האיברים בחממת פחמן דו חמצני. חבר את צינור B לראש משאבה המחובר למשאבה פועמת. סגור את דלת הזכוכית של החממה. ודא שהצינור ממוקם כראוי בין הדלת לאטם הגומי. דגרו את הפיגום הנטול תאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות כדי לאפשר לתאי האנדותל להתיישב בתוך הפיגום. הפעל את המשאבה בקצב של שישה סל"ד, וכתוצאה מכך שני מיליליטר לדקה זלוף מדיה באמצעות צינורות L/S 14. שימו לב לריאה הנטולת תאים המתרחבת מעט עקב זלוף מדיה. לאחר מכן, סגור את דלת החממה. כדי לבצע החלפת מדיה, עצור את כונן המשאבה. חבר מזרק סטרילי של 50 מיליליטר לתא העצירה שלוש, והוצא 50 מיליליטר מדיה מהתא. מלאו עוד מזרק סטרילי של 50 מיליליטר ב-50 מיליליטר של מדיה מחוממת מראש. הזרקו את התמיסה למיכל זכוכית, והעבירו את המדיה לתא באמצעות תא עצירה שלוש, וודא שתא העצירה מוחלף כראוי. הפעל מחדש את המשאבה הפועמת. קצרו את גוש הלב-ריאה המחודש לאחר יומיים של תרבית איברי זלוף. ריאות העכבר נראו לבנות ושקופות לאחר דה-סלולריזציה, מה שמעיד על הסרת רכיבים תאיים, תוך שמירה על מבנה הריאות הכללי. ניתוח היסטולוגי של ריאות עכברים נטולי תאים חשף מבנים מכתשית שלמים, ללא רכיבים תאיים שנותרו. ריאות עכברים שעברו תאים עם שלוש פעמים 10 בחזקת שבעה HUVECs לאחר יומיים של תרבית ביו-ריאקטור מבוססת זלוף, הראו התפלגות הומוגנית של HUVECs. HUVECs נדדו לאזורים מכתשית היקפיים, ויצרו רשת דמוית נימי, כפי שנצפה בריאות מחודשות.