מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

אנו מפתחים ערכות לבדיקות אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס מהירות ורגישות. המטרה כאן היא לעזור לחוקרים לאפיין סוגי תאים שונים המופיעים ברקמת FFPE

אימונופלואורסצנציה מתבצעת בדרך כלל באמצעות נוגדנים משניים המסומנים בצבע או בפרוקסידאז. אימונוהיסטוכימיה נוטה להיות פלקס נמוך. נוגדנים משניים המסומנים בצבע סובלים מאותות נמוכים יותר. מבחני הגברת אותות טירמיד מייגעים לאופטימיזציה ולוקח מספר שעות עד מספר ימים לפעול.

סמני הבדיקות מגיעים מותאמים מראש וזה מהיר משמעותית מטכניקות אחרות. עמידה של ארבעה סמנים אורכת פחות משמונה שעות, וכשלוש שעות נוספות על כל ארבעה סמנים ביולוגיים נוספים.

היכולת להריץ אימונופלואורסצנציה מרובה מהר יותר תאפשר ליישם פרוטאומיקה מרחבית באופן נרחב יותר ותפחית את המחסום להבנת ההקשר המרחבי של הרקמה.

[קריין] כדי להתחיל, יש להפשיר את כל ריאגנטים של הערכה בטמפרטורת החדר. אחסן את צימודי הנוגדנים, אנזים ההגברה, יוזם ההחלפה ומנטרל ההחלפה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. מערבולת, מדלל נוגדנים מופשר. הכניסו את מדלל הנוגדנים למיכל. צנטריפוגה קצרה והוסף את כל הנוגדנים לתמיסת צביעת הנוגדנים מיכל 1. הוסף את מדלל הנוגדנים המסופק בדילול של 1 עד 100. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לערבב את התמיסה בעדינות, הימנע מערבולת. מערבולת את התמיסה המעורבת לפני ההגברה לאחר ההפשרה לערבב היטב. לאחר מכן הוסף את התמיסה למיכל התערובת המתאים. מערבולת, מאגר ההגברה והפיפטה מערבבים את אנזים ההגברה. מדללים את אנזים ההגברה ביחס של 1 עד 10 במאגר ההגברה כדי ליצור את מאגר ההגברה. יש לערבב בעדינות על ידי פיפטינג, תוך הימנעות ממערבולת. לאחר מכן מערבולת וצנטריפוגה את תמיסת הנגד הגרעינית המסופקת ומדללים 1 עד 100 במים טהורים במיוחד. לאחר מכן, יש לדלל בדיקות פלואורסצנטיות 1 תמיסה ביחס של 1 עד 20 במאגר בדיקה. הכנס את שרביט הריאגנט המלא למכשיר כדי לאפשר מדידת נפחי ריאגנטים. נווט אל הכרטיסייה הגדרת שקופיות בחלק העליון של תוכנת הצביעה האוטומטית לאחר הכנת כל הריאגנטים. לחץ על כפתור הוסף מחקר והזן את מזהה המחקר, שם המחקר והערות מחקר לפי הצורך. תחת נפח חלוקה, בחר 150 מיקרוליטר ובחר *הסרת שעווה 4 שלבים כשיטת ההכנה. אם הוא אינו זמין בתפריט הנפתח, פתח את תפריט הגדרת הפרוטוקול, סמן את תיבת הסימון המועדפת עליו ולחץ על אישור. לאחר יצירת המחקר, לחץ על כפתור הוסף שקופית הממוקם בצד ימין של מסך הגדרת השקופיות. הזן שם ייחודי עבור השקופית תחת הערות שקופית. הגדר את סוג הרקמה לבדיקת רקמה בשדה המתאים. לאחר מכן בחר 150 מיקרוליטר עבור נפח החלוקה והגדר את מצב הצביעה לבודד בתפריט הנפתח השמאלי ואת השגרה בתפריט הנפתח הימני. תחת תהליך, בחר IHC, והגדר את הסמן לתמיסת צביעת נוגדנים. בקטע פרוטוקולים של חלון הוספת שקופית, בחר בדיקת צביעה 1 לצביעה, *הסרת שעווה 4 שלבים להכנה ו-*HIER 20 דקות עם ER2 עבור HIER. השאר את פרוטוקול האנזים מוגדר למקף כוכבית ולחץ על הוסף שקופית לאחר השלמת כל השדות. לאחר הוספת כל השקופיות, סגור את החלון הוסף שקופיות והדפס תוויות שקופיות, והצמד כל אחת מהן למקטע הרקמה המתאים. טען כל שקופית עם תווית על המגש והנח אריחי כיסוי על גבי כל קטע טישו. הכנס את מגש ההחלקה למכשיר ובחר את הצביעה האוטומטית המתאימה מהצד הימני של מסך התוכנה. ודא שכל שלושת מגשי השקופיות וכל מידע המגיבים, כולל ריאגנטים בתפזורת ומוכנים, גלויים. בדוק שמיכלי הריאגנטים בתפזורת מלאים כראוי ושלמיכלי הפסולת יש מספיק נפח כדי להשלים את הריצה. לאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל בריצת הצביעה ולהבטיח הסרה בזמן של השקופיות מהמכתים האוטומטי לאחר השלמת ההליך. הנח שקופיות מוכתמות במאגר PBS והחל פתקי כיסוי באמצעות אמצעי ההרכבה. צלם את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או סורק שקופיות שלם עם מסננים התואמים לצבעי הבדיקה. לבדיקת ההחלפה, הפשירו את מאגר ההחלפה בטמפרטורת החדר. שמור את מנטרל ההחלפה ויוזם ההחלפה מאוחסנים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש. הכן שני מיכלי טיטרציה של ריאגנטים ואחזר את ערכת הזיהוי לשימוש במהלך פרוטוקול ההחלפה. מערבולת את מאגר ההחלפה. ופיפטה מערבבים את יוזם ההחלפה. הכן את פתרון ההחלפה במיכל המיועד לו על ידי ערבוב הכמויות הנדרשות של יוזם ההחלפה ומאגר ההחלפה. מערבבים את התוכן על ידי פיפטינג בלבד. כעת שלב את תמיסת הבדיקות הפלואורסצנטיות 2 עם מאגר ההחלפה המדולל במיכל המתאים. מערבולת: רק מאגר הגשושית ותערובת הבדיקה הפלואורסצנטית והפיפטה מערבבים את התמיסה הסופית. הנח את שרביט הריאגנט המלא עם כל הריאגנטים המוכנים על הצביעה האוטומטית. אפשר למכונה לבצע בדיקת טבילה על כל הריאגנטים. לאחר הוספת השקופיות, הגדר את הסמן ל- *שלילי. ועבור הכנה, HIER ואנזים, בחר באפשרות מקף הכוכבית, מכיוון שאין צורך בהסרת שעווה או אחזור אנטיגן עבור פרוטוקול ההחלפה. לחץ על הוסף שקופית בסיום. לאחר הוספת כל השקופיות, סגור את החלון הוסף שקופית והדפס תוויות שקופיות שיודבקו לכל מקטע טישו מתאים. טען כל שקופית על המגש והנח אריח כיסוי מעל כל קטע טישו לפני הנחת המגש לתוך הצביעה האוטומטית. כעת לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל את הריצה. תמונות של ליבת מיקרו-מערך רקמות שצולמו על פני שני סבבי צביעה באמצעות פרוטוקול אימונופלואורסצנטי של שמונה פלקסים הראו סמנים חיסוניים מובהקים בכל סבב, עם רישום משותף מוצלח של תמונה המשלב את שני הסיבובים לכדי קומפוזיציה מאוחדת. הדמיית שקופיות שלמה של רקמת סרטן המעי הגס אפשרה זיהוי של פנוטיפים חיסוניים על סמך קולוקליזציה של סמנים, כולל תאי T רגולטוריים, תאי T מותשים ומקרופאגים מדכאי חיסון. צביעה אימונופלואורסצנטית הראתה ביטוי משותף של CD3, CD4 ו-FoxP3 בתאי T רגולטוריים. PD1 ו-PDL1 בגידול ובתאי סטרומל. CD3, CD8 ו-PD1 בתאי T ציטוטוקסיים מותשים. ו-CD 68 ו-PDL1 במקרופאגים מדכאי חיסון. השוואה בין אימונוהיסטוכימיה של סמן יחיד ואימונופלואורסצנציה בודדת או מרובה אישרה התאמה איכותית בדפוסי צביעה על פני כל הסמנים. צביעת חתך סדרתי על פני סוגי רקמות שונים אישרה דפוסי ביטוי עקביים של סמנים חיסוניים עם ליבות רקמה מייצגות, והראו צביעה מוצלחת ושונות מינימלית. קטעי שקדים מוכתמים בשש שקופיות טוריות עבור CD8 הפגינו יכולת שחזור גבוהה עם חלוקת אות כמעט זהה בכל התמונות. כימות צפיפות תאים חיובית לסמן בין סוגי רקמות הראה את הצפיפות הגבוהה ביותר בשקדים ובבלוטות הלימפה, והנמוכה ביותר במלנומה ובמעי הגס.