Name: מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: למד פרוטוקול אוטומטי לאימונופלואורסצנציה מרובה לחקר פרוטאומיקה מרחבית ברקמות FFPE. השיטה מציגה שחזוריות גבוהה ומאפשרת זיהוי סוגי תאים שונים במחקר תרגומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Comm%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+tumor+heterogeneity+and+diagnostic+profiling+for+advanced+and+immune+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies.</a> Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).</li>
<li>Singhal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaiso+%28ZBTB33%29+subcellular+partitioning+functionally+links+LC3A%2FB%2C+the+tumor+microenvironment%2C+and+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival.</a> Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Patil, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+plasma+cells+predict+outcomes+to+PD-L1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).</li>
<li>Hong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+T+cell+therapy+for+MAGE-A4%2B+solid+cancers+in+HLA-A%2A02%2B+patients%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).</li>
<li>Robbins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-institutional+Assessment+of+Pathologist+Scoring+HER2+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+HER2-Low+a+New+Clinical+Entity+or+Merely+a+Biomarker+for+an+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Ther%22%5BJournal%5D)">Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate.</a> Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).</li>
<li>Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+low+can+you+go%3F+PD-L1+expression+as+a+biomarker+in+trials+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy.</a> Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Performing+Immunofluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining.</a> Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Immunofluorescence%3A+A+Powerful+Tool+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy.</a> Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+%28IHC%29+and+immunofluorescence+%28IF%29+staining+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).</li>
<li>Myers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+automated+slide+stainers+for+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Medl+Lab+Obser%22%5BJournal%5D)">A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).</li>
<li>Schwarze, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+administration+of+CD1c+%28BDCA-1%29%2B+and+CD141+%28BDCA-3%29%2B+myeloid+dendritic+cells+in+combination+with+talimogene+laherparepvec+in+immune+checkpoint+blockade+refractory+advanced+melanoma+patients%3A+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial.</a> J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Koppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+PD-L1+immunohistochemistry+staining+protocols+using+the+antibody+clone+28-8+on+different+staining+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms.</a> Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+Requirements+and+Recommendations+for+Multiplex+Immunofluorescence+Tyramide+Signal+Amplification+Assays+to+Support+Translational+Oncology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies.</a> Cancers. 12 (2), 255(2020).</li>
<li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Multiplex+Immunofluorescence+Panel+for+Immuno-oncology+Studies+on+Formalin-fixed+Carcinoma+Tissue+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens.</a> J Vis Exp. (143), e58390(2019).</li>
<li>Hinck, L., Näthke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cell+and+tissue+organization+in+cancer+of+the+breast+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon.</a> Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).</li>
<li>Alturki, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Immune+Checkpoint+Inhibitors+in+the+Context+of+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment.</a> J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).</li>
<li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+therapy+for+solid+tumours%3A+clinical+dilemmas+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).</li>
</ol>

אימונופלואורסצנציה מרובת מאוד (mIF) היא טכניקה מתקדמת המחוללת מהפכה בתחום ניתוח הרקמות בכך שהיא מאפשרת הדמיה בו-זמנית של סמנים ביולוגיים מרובים של חלבונים בתוך קטע רקמה יחיד 1,2. יכולת זו מספקת רמת פירוט ורזולוציה מרחבית שאין שני לה, שלעתים קרובות חיונית להבנת האינטראקציות בין סוגי תאים עם מורפולוגיות מורכבות בתוך מיקרו-סביבת הרקמה על פני קני מידה מרחביים מרובים3. הטכניקה חשובה במיוחד במחקר אונקולוגי, שם ניתן להשתמש בה כדי למקם סמנים ביולוגיים של גידול, מטרות תרופות חלבון, מצב החיסון המקומי ונקודת הביקורת, האינטראקציות בין סוגי תאים שונים, ואפילו דפוסי הקולוקליזציה התת-תאיים הקשורים למטבוליזם של התרופהבתוך הרקמה 4,5,6.
למרות הפוטנציאל שלה, רוב טכנולוגיות ה-mIF עדיין מתמודדות עם אתגרים משמעותיים, במיוחד באיזון בין רגישות ותפוקה לבין יכולות ריבוב. מגבלה זו קריטית במיוחד לאיתור סמנים ביולוגיים קליניים שיכולים להראות ביטוי נמוך מאוד כגון HER2 ו-PD-L1 7,8,9. כדי להבין מדוע זה כך, חיוני להבין שיטות אחרות של mIF. שיטות מסורתיות אלו סללו את הדרך לפלטפורמות mIF מתוחכמות יותר, אך הן מגיעות עם סטים משלהן של יתרונות ומגבלות.
אימונופלואורסצנציה ישירה (DIF) משתמשת בנוגדנים המצומדים ישירות לפלואורופורים, או לאוליגונוקלאוטיד המסוגל לגייס פלואורופורים10. שיטה זו פשוטה לריבוי אך סובלת מרגישות נמוכה יותר וקושי בפתרון אות מרקע רקמות או חפצי צביעה.
אימונופלואורסצנציה עקיפה (IIF) משתמשת בנוגדנים משניים שנקשרים לנוגדנים הראשוניים. זה הגדיל את האות בהשוואה ל-DIF מבוסס ראשוני. בשילוב עם עיצובים משופרים של תאי זרימה, IIF רציף יכול לזהות עד 40 סמנים ביולוגיים בבדיקה אחת 2,11. עם זאת, אלה עדיין סובלים מחוסר רגישות יחסי בהשוואה לאסטרטגיות מבוססות אנזימים להגברת אותות, כמו אלה שנמצאות בטכניקות אימונוהיסטוכימיה (IHC).
אימונופלואורסצנציה מבוססת קטליזה של אנזים נראית לרוב בשיטות IHC המשתמשות בחזרת פרוקסידאז (HRP) לתצהיר צבע כרומוגני (DAB) או פלואורסצנטי (למשל, הגברת אות טירמיד (TSA)). מכיוון שבדיקות אלו מבוססות על אותו אנזים קטליטי, רגישות הזיהוי שלהן דומה, מה שהופך את מבחני mIF מבוססי TSA רב-ספקטרליים למתאימים ליישומים קליניים 2,12. היתרון של הגברת אותות מבוססת DNA הוא דרגת הריבוב הגבוהה האפשרית תוך שמירה על הגברת אותות ומודולריות מצוינים. לעומת זאת, שיטות מבוססות HRP הן פחות מודולריות וקשות לאופטימיזציה, ודורשות מחזורי פיתוח ובדיקה נוספים של פאנלים.
אימונופלואורסצנציה של נוגדנים ברקודים ב-DNA בדיקת ה-mIF המודגמת כאן משתמשת ב-DNA פולימראז כדי להגביר בו זמנית נוגדנים מקודדים ב-DNA, ואחריהם מחזורים של צביעה והימנעות של בדיקה מדווחת באמצעות ארבעה אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים לכל סבב הדמיה (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg"> 
איור 1: איור גרפי של פרוטוקול בדיקת אימונופלואורסצנציה מרובה. נוגדנים מצומדים לברקוד מתווספים בשלב אחד, והברקודים מוגברים בו זמנית. קבוצות של ארבעה בדיקות פלואורסצנטיות מתווספות בכל מחזור, ומאפשרות לדמיין ארבעה סמנים בבת אחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
תוספת נוגדנים חד-סיבובית זו והגברה חד-שלבית מפשטת מאוד את פרוטוקול הבדיקה. התהליך מתאפשר על ידי מערכות צביעה וסריקה אוטומטיות בתפוקה גבוהה, המבטיחות תוצאות הניתנות לשחזור משקופית לשקופית ומאצווה לאצווה על פני מספר רב של דגימות המשמשות במחקרים קליניים13.
אחד היתרונות העיקריים של טכנולוגיה זו הוא יכולתה לשמור על רגישות גבוהה תוך מתן אפשרות לריבוב נרחב2. זרימת העבודה גם מבטיחה שתפוקת ההדמיה תישאר גבוהה, ובכך נותנת מענה לאחת המגבלות העיקריות של טכנולוגיות mIF מרובות מאוד (למשל, &gt; 8 סמנים ביולוגיים) למחקרים קליניים. זה חשוב במיוחד במחקר קליני, שבו וריאציות עדינות ביעדי התרופות בשפע נמוך (למשל, HER2 נמוך) בין מטופלים יכולות לספק תובנות קריטיות לגבי התגובה הטיפולית.
בנוסף לתכונות מפתח אלה, בדיקה זו מספקת גם יכולת תצורה של פאנל, יכולות הדמיה של שקופיות שלמות בתפוקה גבוהה ורזולוציה אופטית הנחוצה לחקירת תהליכים ותאים תת-תאיים, כמו גם בליטות תאיות הקשורות למקרופאגים ותאים דנדריטיים. היכולת לחקור פנוטיפים תאיים מורכבים על פני קני מידה מרחביים מרובים היא יתרון קריטי של הדמיה אופטית לעומת שיטות מבוססות ציטומטריית מסה הדמיה (IMC)2.
בעבודה זו מוצג פרוטוקול לבדיקת mIF 8-plex באמצעות מכתים אוטומטיים וסורק שקופיות שלמות. בדיקה זו כוללת פאנל של שמונה נוגדנים עיקריים: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 ופאן-ציטוקרטין14. פאנל סמנים זה יאפשר פרופיל חיסוני של רקמת הגידול וזיהוי תאים הנמצאים בסביבת הגידול או הסטרומה. פרוטוקול זה משתמש במכתים שקופיות אוטומטי עבור סבבי צביעה והחלפת בדיקה ראשוניים, וניתן להשלים את הצביעה וההדמיה תוך יומיים. מוצגות גם שיטות לאימות בדיקת mIF וביצוע ניתוח של התמונות המתקבלות.

<table><tbody><tr><td>שיבוט אנטי-CD3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>BC33 (BioCare). חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone SP35 (Abcam). חלק משיבוט</td></tr><tr><td>אנטי-CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801 KP1 (BioCare). חלק משיבוט</td></tr><tr><td>אנטי-CD8</td><td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801 C8/144B (BioCare). חלק</td></tr><tr>משיבוטי<td>אנטי-ציטוקרטין ULT50801 + אנטי-SOX10</td><td>Ultivue</td><td></td><td>AE1/AE3 (Bethyl Labs) ו-BC34 (BioCare). חלק ULT50801, מסופק כתערובת</td></tr><tr><td>Anti-FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7 (תרמו). חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-PD1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone CAL20 (Abcam). חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-PDL1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 73-10 (Abcam). חלק</td></tr><tr><td>ממיקרוסקופ ULT50801 Axioscan.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>הנקרא מיקרוסקופ פלואורסצנטי בטקסט</td></tr><tr><td>Bond Dewax Solution</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Bond Epitope Retrieval Solution 2</td><td>Leica</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>Bond Open Containers, 30 מ"ל</td><td>Leica</td><td>OP309700</td><td></td></tr><tr><td>ערכת גילוי מחקר בונד</td><td>Leica</td><td>DS9455</td><td></td></tr><tr><td>תוספות טיטרציה של בונד</td><td>Leica</td><td>OPT9049</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיטרציה</td><td>של Leica Leica</td><td>OPT9719</td><td></td></tr><tr><td>Bond אוניברסלי Covertiles</td><td>Leica</td><td>S21.4611</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת שטיפת בונד 10x תרכיז</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>BondRX Autostainer</td><td>Leica</td><td></td><td>נקרא "autostainer" בטקסט</td></tr><tr><td>תוכנת</td> <td>BondRXLeica</td><td></td><td>גרסה 6.0 ואילך</td></tr><tr><td>Coverslips, #1.5 עובי</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 200 הוכחה</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE רקמות גושי רקמות</td><td>BioIVT</td><td></td><td>משתנים מבחן</td></tr><tr><td>OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)</td><td>Ultivue</td><td>ULT50801</td><td>מכיל את כל שאר רכיבי Ultivue</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F</td> <td>(pH 7.4 עם 2.7 מ"מ KCl ו-137 מ"מ NaCl)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td>נקרא "מדיום הרכבה" בטקסט</td></tr><tr><td>UltiAnalyzer.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltiStacker.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultivue הגברה מאגר</td><td>Ultivue</td><td></td><td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue נוגדנים מדלל</td><td>Ultivue</td><td></td>, <td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td>, <td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Initiator</td><td>Ultivue</td><td></td>, <td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Neutralizer</td><td>Ultivue</td><td></td>, <td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Fluorescent Probes 1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Fluorescent Probes 2</td><td>Ultivue</td><td></td><td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Pre-Amplification Mix</td><td>Ultivue</td><td></td><td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Probe Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>חלק מ-ULT50801</td></tr><tr><td>Ultrapure</td><td>Water Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

בעקבות הפרוטוקול לעיל, רקמת FFPE תהיה מוכתמת במספר מטרות, והתקבלו תמונות באיכות גבוהה של כל הסמנים בקבוצות של ארבעה (איור 3A,B). תוכנת הרישום המשותף של התמונות תאפשר לשלב ולרשום תמונות מאותה שקופית, כפי שניתן לראות באיור 3C. תוצאות דומות מוצגות באיור 4 עבור שקופית רקמת סרטן המעי הגס (CRC).
יש לקבוע את הצלחת הפרוטוקול על ידי הערכת דפוס הצביעה הצפוי. בדוגמת ה-CRC המוצגת, כל אחת מהמטרות המוכתמות מתבטאת בתא התת-תאי הצפוי, למשל, FoxP3 גרעיני, CD3 קרומי, CD68 ציטופלזמי (איור 4B-D). כל אחת מהמטרות התפקודיות מתבטאת בסוג התא המתאים, כפי שמודגם על ידי הדוגמה של לוקליזציה משותפת של PD1 ו-CD3 או של PDL-1 ו-CD68, המראים תאי T מותשים ומקרופאגים מדכאי חיסון, בהתאמה. הערכה של יחס אות לרקע טוב, המאפשר הבחנה מוצלחת בין אות חיובי אמיתי לרעשי רקע פוטנציאליים, מבוצעת בדרך כלל באופן איכותי על ידי פתולוגים או מומחי ניתוח תמונה המאשרים את איכות הצביעה, ומאפשרים ניתוח תמונה מוצלח. כדי לאשר עוד יותר את איכות הצביעה והביצועים, ניתן להוסיף השוואה לתקן הזהב IHC (DAB כרומוגני) בחתכים טוריים (ראה דוגמה באיור 5), כמו גם דגימת רקמת בקרה חיובית כגון שקד אנושי אשר עבור רוב המטרות החיסוניות, יכולה להיות שימושית כדי לאשר את הצלחת ריצת הצביעה. שימו לב שסרטן עשוי להראות ביטוי נמוך יותר של מטרות מאשר שקדים אנושיים16.
לאחר אישור התוצאות באופן איכותי, ניתן לבצע ניתוח כמותי. בעבודה זו, זה מורכב בעיקר מחישוב צפיפות התאים של פנוטיפים שונים (מספר תאים/מ"מ 2) המבטאים מטרה או מטרות מסוימות, כמו גם חישוב רמות העוצמה הממוצעות של מטרות פונקציונליות שיכולות להראות טווח דינמי רחב של ביטוי. בעת הערכת הדיוק של מבחני mIF, חתכים טוריים המוכתמים באותם סמנים צריכים להראות אותות דומים בין שקופיות, אותם ניתן לראות באופן איכותי באיור 6. דוגמה לתוצאות כמותיות של צפיפות סמן בודד בסוגי רקמות שונים מוצגות באיור 7. ניתוח תמונה בתמונות אלה מאפשר לזהות תאים חיוביים, וניתן לחשב צפיפות תאים חיובית מתאימה עבור כל סמן, כמו גם את עוצמת האות הממוצעת לכל תא חיובי. זה מאפשר לחשב מקדם שונות (CV) עבור כל סמן כדי להעריך את הדיוק של בדיקת הריבוב (טבלה 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg"> 
איור 3: תמונות של ליבת מיקרו-מערך רקמות (TMA) המתקבלות מסבבים עוקבים של צביעה בפרוטוקול אימונופלואורסצנטי 8-plex. (A) תמונה שהתקבלה מסבב ההדמיה הראשון, הכוללת את הסמנים CD8, PD1, PD-L1 ו-CD68. לאחר פרוטוקול ההחלפה, (B) מציג את סבב ההדמיה השני באותה שקופית עבור הסבב השני של הסמנים CD3, CD4, FoxP3 ו-CK/SOX10, ו-(C) מציג תמונה שנרשמה במשותף המשלבת תמונות (A) ו-(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg"> 
איור 4: צביעה מייצגת של רקמת סרטן המעי הגס (CRC) עם צביעה אימונופלואורסצנטית 8-plex. האיור מציג פנוטיפים תאיים שניתן לזהות על ידי מיקום משותף של מספר מטרות באותו תא. (למעלה) תמונת שקופית שלמה של רקמת CRC. (למטה) תצוגות מפורטות של אזורים של הדגשת רקמות (A) תאי T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) תאים המבטאים PD-1 ו-PD-L1 בתוך גידול וסטרומה, (C) תאי T ציטוטוקסיים מותשים (CD3+/CD8+/PD-1), (D) תאי גידול מתחמקים ממערכת החיסון (PD-L1+/CK+) ומקרופאגים מדכאי חיסון (CD68+/PDL1+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg"> 
איור 5: השוואה איכותית של צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) לצביעה אימונופלואורסצנטית (IF). חתכים סדרתיים מוכתמים בצביעה אימונוהיסטוכימית של סמן יחיד (DAB, שורה עליונה), אימונופלואורסצנציה של סמן יחיד (מונופלקס ISP), ותצוגה חד-ערוצית של אימונופלואורסצנציה מרובה (ISP multiplex) המדגימה התאמה איכותית בין שיטות הצביעה השונות. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg"> 
איור 6: צביעת חתך טורי. (A) דיאגרמה המציגה את הפריסה של TMA רב-רקמות. (B) תמונות מייצגות של 8 פלקס של ליבות רקמה מכל סוג רקמה ב-TMA. (C) תמונות מייצגות של CD8 בליבת שקדים על פני שישה מקטעי TMA טוריים מוכתמים בריצה אחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg"> 
איור 7: כימות צפיפות סמן יחיד לכל סוג רקמה הכלול ב-TMA. צפיפויות לרקמה הן הצפיפות הממוצעת על פני שלוש ליבות מייצגות של כל סוג רקמה בשקופית TMA. ציר ה-y מייצג את צפיפות הסמן הבודד בסוגי רקמות שונים על ציר ה-x, ביחידות של תאים חיוביים/מ"מ2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg"> 
איור 8: ניתוח אזור עניין (ROI) של אות פלואורסצנטי יחסי המשווה את ה-ISP mIF המוגבר המתואר בפרוטוקול זה ל-IF עקיף. (A) שקופית מייצגת מוכתמת עבור CK (משמאל) או PD-L1 (מימין) עם חמישה החזר ROI מצוין. (B) תמונות מייצגות של החזר ROI עבור CK (למעלה) ו-PD-L1 (למטה). עוצמת האות הממוצעת הושגה עם mIF מוגבר (סגול) ו-IF עקיף (כחול) עבור (C) CK ו-(D) PD-L1 על פני חמישה החזר ROI, כל אחד בגודל 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר ומכיל כ-200 תאים. ערכי ציר Y מראים יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ופסי שגיאה מראים סטיות תקן (n=3). (E) עוצמת האות היחסית שהושגה עם ספק שירותי אינטרנט מוגבר mIF (סגול) ו-IF עקיף (כחול) חושבה על ידי לקיחת היחס בין אות ה-mIF המוגבר הממוצע לאות ה-IF העקיף הממוצע בכל החזר ה-ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 4: מקדם שונות מחושב (CV). CV של צפיפות תאים חיובית ועוצמת האות הממוצעת עבור תמונות השקדים מוצגים באיור 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>

Multiplex immunofluorescence (mIF) is an advanced technique that allows for detailed, spatially resolved analysis of tissue samples by visualizing ...

high-throughput-automated-multiplex-immunofluorescence-assays-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

שימוש בטכנולוגית microsphere Xmap של Luminex החברה, פתחתי immunoassay Fluorometric Multiplexed (MFIA) לserosurveillance של מיני בעלי חיים שונים במעבדה. MFIA הוא microarray השעיה בי אנטיגן, בקרת רקמה או נוגדנים קשורות קוולנטית לקלקר microspheres צבעים. שיטת בדיקת MFIA כמו גם נושאים שונים לפתרון בעיות מטופלות.

מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

פרוטוקול מפורט עבור לוח שש-marker immunofluorescence מולטיפלקס אופטימיזציה שבוצעו, באמצעות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות עבור תוצאות עקביות יותר זמן הליך קצר יותר. גישה זו ניתן להתאים ישירות על ידי כל מעבדה לחקר חיסונית-אונקולוגיה.

לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע

כאן נתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס immunohistochemical פלורסנט מכתים והדמיה עבור ההתאמה סימולטני של אנטיגנים מרובים הקשורים לסרטן ב לימפומה. פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הניתוח colocalization של סמנים ביולוגיים בתוך כל מקטעי רקמת.

מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

הטכנולוגיה המתהווה של מולטיפלקס מאפשרת הדמיה של סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה הקבועה, שאינה מוטבעת ברקמת פרפין (FFPE). הציגו הם הנחיות להבטחת מולטיפלקס 7-צבע מוצלח עם הוראות אופטימיזציה של נוגדנים וריאגנטים, הכנת שקופיות, עיצוב וטיפים להימנעות בעיות נפוצות.

אופטימיזציה, עיצוב והימנעות החסרונות בתוך מולטיפלקס במגה ומין אימונוהיסטוכימיה

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

בדיקות אוטומטיות באמצעות מיקרו-פלטות מרובות היטב הן גישות מועילות לזיהוי רגולטורים של מסלולים בכך שהן מאפשרות הערכה של מספר רב של תנאים בניסוי אחד. כאן, התאמנו את פרוטוקול ההדמיה והכימות של המקרופינום המבוסס היטב לפורמט מיקרו-לוחית של 96 בארות ומספקים מתאר מקיף לאוטומציה באמצעות קורא לוחות רב-מצבי.

הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות

במאמר זה מתואר פרוטוקול להגברת אות טירמיד ידנית (TSA) מולטיפלקס אימונופלואורסנציה (mIF) בשילוב עם ניתוח תמונה וניתוח מרחבי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם מקטעים משובצי פרפין קבועים פורמלין (FFPE) לצביעה של שניים עד שישה אנטיגנים לכל שקופית, בהתאם לסורק השקופיות הזמין במעבדה.

מולטיפלקס אימונופלואורסנציה בשילוב עם ניתוח תמונה מרחבית להערכה קלינית וביולוגית של מיקרו-סביבה של הגידול

היישום של טכניקת הקרנה פוטו-ארבלית בעלות נמוכה בשיטת IBEX הידנית מאפשר הדמיה אופטימלית של רקמות אנושיות עם אוטופלואורסצנציה טבעית משמעותית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשיג תמונות מרובות ושקופיות שלמות מדגימות קליניות בארכיון באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ריאגנטים זמינים באופן נרחב ותוכנת קוד פתוח ליישור ועיבוד תמונה.

זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד

אימונופלואורסצנציה מרובה מאפשרת תיוג רציף של מספר סמני נוגדנים בתוך חתך רקמה אחד כדי לתמוך בניתוח מרחבי של ארכיטקטורת הרקמה ואוכלוסיות התאים. כאן מוצגת זרימת עבודה לזיהוי מולטיפלקס של סמנים מבניים וחיסוניים הקשורים להזדקנות, הכוללת הכנת שקופיות ידנית ואוטומטית, הדמיה איטרטיבית וניתוח תאים בודדים באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית.

מבחן אימונופלואורסצנציה מרובה לצורך הערכה מרחבית של סמני הזדקנות ב-vivo

למד פרוטוקול אוטומטי לאימונופלואורסצנציה מרובה לחקר פרוטאומיקה מרחבית ברקמות FFPE. השיטה מציגה שחזוריות גבוהה ומאפשרת זיהוי סוגי תאים שונים במחקר תרגומי.

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

גלה סרטונים נוספים