Name: אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: חקור מניפולציה גנטית באלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בתאי מקור עצביים ומנגנוני התפתחות מוח אנושית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>נוקאאוט גנטי CRISPR/Cas9 באורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים באמצעות אלקטרופורציה

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה PP 15 מ"ל</td>, <td>קורנינג</td><td>חרוטי 430791</td><td></td></tr><tr><td>יחידת ליבה 4D-Nucleofector</td><td>יחידת לונזה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X יחידה</td><td>לונזה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td>פלקון 352235</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות, מטופל ב-Thermo</td><td>Fisher</td><td>140675</td><td>עבור hiPSC תרבית</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות, חיבור נמוך במיוחד</td><td>קורנינג</td><td>3471</td><td>לתרבית אורגנואידים</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>מדיום מוח קדמי 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>מדחס אוויר</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד עוף IgY (IgG) (H+L)</td> <td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>נוגדן משני, RRID: AB_2340375; דילול 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>נוגדן משני, RRID: AB_162543; דילול 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td></td><td>עיצוב מותאם אישית (סדר כ-2 ננומול)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>1072532</td><td>5 ננומול</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>1081060</td><td>100 ומיקרו; גרם, מסטרפטוקוקוס פיוגנס</td></tr><tr><td>אמפוטריצין B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>מדיום המוח הקדמי 2, 3 ו-4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני נגד GFP (עוף, פוליקלונלי)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; דילול 1:2000</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני Anti-PCGF4 (עכבר, חד שבטי)</td><td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; דילול 1:300</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>מדיום המוח הקדמי 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-supplement (+ ויטמין A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Forebrain medium 3, 4&nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr> <tr><td>ערכת כבלים למיקרו-תופס</td><td>מכשיר הרווארד BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>ביומטרה, TRIO-Thermocycler (מכונת PCR)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>נימים, זכוכית בורוסיליקט עם נימה, OD 1.2 מ"מ; מזהה 0.69 מ"מ; אורך 10 ס"מ</td><td>מוצרי מדע</td><td>BF120-69-10</td><td>יש למשוך לעובי ספציפי</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Forebrain medium 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>מתקן הנדסת תאי גזע ב-CMCB DD</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>קו hiPSC מותאם לתאים בודדים מתורם בריא</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>מלאי של 1 מ"ג/מ"ל, השתמש ב-1:1000 מדולל עבור IF</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>מדיום קדמי 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Forebrain medium 1, 2 ו-3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>Forebrain medium 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים, סטריגט, 11 ס"מ</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 מערכת אלקטרופורציה של גל מרובע</td><td>מכשיר הרווארד BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>למשיכת מיקרו-נימים</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software גרסה 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; נוקלאוטידים מסומנים בקו תחתון = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>מדיום המוח הקדמי 1, 2, 3 ו-4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>מאמר</td><td></td> זה <td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (תואם לתמונות ה-KO באיור 3I+J)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>מאמר</td><td></td> זה <td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (תואם ל-KO תמונות באיור 3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>1 מיליון</td></tr><tr><td>מלאי סרום סוסים,</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Human GDNF Recombinant Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Forebrain medium 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>אדם/עכבר/חולדה BDNF חלבון רקומביננטי</td><td>תרמו פישר</td><td>450-02</td><td>מוח קדמי בינוני 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>לייצור TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (שעווה) Pen</td><td>Vector Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אינסולין אנושית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>מוח קדמי בינוני 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>מוח קדמי בינוני 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>לייזר סריקת לייזר קונפוקלי 980 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נקודת התכה נמוכה אגרוז,</td><td>16520100</td><td>תרמו פישר</td> טהור במיוחד <td>להטמעת hCOs במהלך חתך ויברטום</td></tr><tr><td>מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס,</td><td>קורנינג</td><td>354230</td> ללא LDEV <td>לתרבית</td></tr> <tr><td>אורגנואידיםמטריצה מוסמכת hESC של Matrigel,</td><td>354277 קורנינג</td><td></td> נטולת LDEV <td>לתרבית hiPSC</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td><td>תרמו פישר</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק PicoPump + מתג רגל</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה של מיקרו-מעמיס 0.5 עד 20 ומיקרו; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>להעמסת נימי זכוכית</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>מדיום תאי גזע</td></tr><tr><td>N-2 תוסף</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Forebrain medium 2 ו-3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB הבא High Fidelity 2x PCR Mastermix&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה נויבאואר</td><td>מותג</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>מדיום מוח קדמי&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</sup</td></tr><tr><td>>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>מדיום המוח הקדמי 1, 2, 3 ו-4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15מאגר</td></tr> <tr><td>דופלקס נטול נוקלאז</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות 1072570</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O. C. T.</td><td>Compound Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>מדיום הטמעה לדגימת רקמה קפואה</td></tr><tr><td>P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>עובש הטבעה Peel-A-Way TruncatedT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>להטמעת hCOs לוויברטום וחתך קריו</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Forebrain בינוני 1, 2, 3 ו-4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 ולמדיום תאי גזע לאחר נוקלאופקציה</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ, ללא אוורור,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי תא אלקטרודה פלטינה, פער 5 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)</td> <td>תוצרת בית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>מאלבום Titrachium; מלאי 10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>מעכב מסלול RHO/ROCK (Y-27632)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>מדיום המוח הקדמי 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז&nbsp;</td>שקופיות הידבקות <td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 עם KL 300 LED</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>או סטריאוסקופ חלופי</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>הידוע גם בשם Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>להכנת TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td></td><td>12604021 דיסוציאציה enzmye לייצור תרחיפים חד-תאיים</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>הידוע גם בשם Polysorbate 20</td></tr><tr><td>Tyrode's salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>רוטט מיקרוטום (ויברטום)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>רחב קדח 1000 ומיקרו; L טיפים מסננים אוניברסליים</td><td>קורנינג</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>מוח קדמי בינוני 1, 3 ו-4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

אבלציה גנטית בתיווך CRISPR/Cas9 דורשת תכנון של gRNAs. באופן כללי, מיקוד אחד האקסונים הראשונים של גן מעניין עם זוג gRNA במרווחים של 7-11 bp זה מזה (הימנעות מכפולות של 3 bp) עובד היטב (איור 1A). כבדיקה ראשונה, ניתן לחקור את יעילות זיהוי התבניות על ידי gRNA במבחנה באמצעות תבנית PCR 26,40,62. מיקוד יעיל וחיתוך בתיווך Cas9 נראים בהפחתת הדנ"א של התבנית ובהופעה של תוצרי דנ"א שסועים על ג'ל אגרוז (איור 1B). בדיקות gRNA נוספות עשויות להתבצע בקו iPSC המשמש לייצור אורגנואידים קליפת המוח. לשם כך נדרשת גרעין של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), אשר ניתן להמחיש באמצעות ביטוי מוצלח של כתב פלואורסצנטי (איור 1C). ניתן לאמת מיקוד יעיל של מוקד העניין על-ידי ריצוף סנגר, והתוצאה היא כרומטוגרמה שמסתיימת בפתאומיות או הופכת למונחת סביב אתר המיקוד (איור 1D), כתוצאה מספקטרום של אינדל מתיקון שבר דו-גדילי על-ידי חיבור קצה לא הומולוגיל-66. מדריך בדיקות יעילות RNA במבחנה ובתאי iPSC מסייעים בבחירת זוגות gRNA יעילים לאבלציה גנטית באורגנואידים קליפת המוח.
לפני האלקטרופורציה חותכים אורגנואידים קורטיקליים, מה שתומך בזיהוי לומן חדרי להזרקה של תערובת האלקטרופורציה (איור 2A-C). אורגנואידים מוזרקים מועברים לאחר מכן לתא האלקטרופורציה (איור 2D). עבור אלקטרופורציה, יש להשתמש באורגנואידים קורטיקליים עם מבנים דמויי חדרים מפותחים היטב (איור 2E), בעוד שאורגנואידים קורטיקליים חסרי מבנים נראים לעין צריכים להיזרק (איור 2F). תערובת האלקטרופורציה מכילה צבע המאפשר הדמיה של חדרים מוזרקים במהלך ההליך (איור 2G). לאחר 1-3 ימים בתרבית, חדרים ממוקדים בהצלחה נראים על-ידי אות GFP טבעי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2H).
לניתוח היסטולוגי מעמיק, ניתן לבצע אימונוהיסטוכימיה של קריוסקציות. באופן אידיאלי, מספר חדרים ממוקדים נמצאים בתוך אורגנואיד קליפת המוח מחושמל (איור 3A,B). האלקטרופורציות האופטימליות ביותר מכוונות למבנים דמויי חדרים באזור החיצוני של האורגנואיד הפונה החוצה (איור 3C), מאחר שאלה הם בדרך כלל החדרים המורחבים ביותר. במקרים מסוימים, אלקטרופורציה עלולה להוביל למוות יתר של תאים (איור 3D,E), לדוגמה, כאשר ריכוזי הפלסמיד גבוהים מדי או כאשר הגדרות האלקטרופורציה אינן אופטימליות. אלקטרופורציות הפונות לחלק הפנימי של האורגנואיד (איור 3F) מערבות לעתים קרובות אזורים פחות מורחבים של מבנים דמויי חדרים בהשוואה לחלק החיצוני. מניסיוננו, כדאי למקד את הניתוח הכמותי באזורים מוגדרים של האורגנואיד כדי להפחית את השונות. לפעמים, אלקטרופורציה עלולה לגרום להפרעה במשטח האפי (איור 3G), לדוגמה, כאשר נפח ההזרקה גבוה מדי, מה שגורם לחדרים להיקרע, או כאשר פולסים חשמליים חזקים מדי, מה שמוביל לדלמינציה של תאים. לבסוף, כאשר שני חדרים סמוכים מכוונים (איור 3H), ייתכן שיהיה קשה לקבוע את גבולות אזורי קליפת המוח ואת מקורם של תאי המטרה.
ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה כדי לאמת נוקאאוט מוצלח בתיווך קריספר/Cas9 ברמת החלבון בתאים המעניינים (איור 3I), כפי שמודגם כאן על-ידי התמקדות בחלבון Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) PCGF467. ניתן לנתח את עוצמת האות בתאים חיוביים ל-GFP בבקרה לעומת בתנאי ניסוי (איור 3J). לחלופין, אם אין נוגדן מתאים זמין, תאים ממוקדים עשויים להיות מבודדים על ידי FACS מאורגנואידים קליפת המוח60 ומנותחים עוד יותר על ידי Sanger או Next Generation Sequencing36. יתר על כן, ניתן לנתח את הפחתת רמות החלבון גם באמצעות כתמים מערביים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
איור 1: תכנון ואימות של רנ"א מנחה לנוקאאוט גנטי חריף בתיווך CRISPR/Cas9. (A) המחשה סכמטית של אסטרטגיית תכנון הרנ"א המנחה (gRNA), עם שני gRNA המכוונים לאקסון של גן מעניין. חצים שחורים מציינים פריימרים PCR להכנת תבנית המשמשים לאימות gRNA. (B) אימות יעילות gRNA במבחנה. תבניות מוגברות PCR עוכלו עם מתחמי RNP. לאחר מחשוף מוצלח, ניתן לראות שני פסים בגדלים שונים לאחר אלקטרופורזה בג'ל (משמאל), בעוד שהתבנית נשארת לא חתוכה עבור gRNA ביעילות נמוכה (מימין). (C) תמונת שדה בהיר (משמאל), פלואורסצנטיות GFP (באמצע) ותמונות ממוזגות (מימין) של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) 3 ימים לאחר נוקלאופקציה עם קומפלקס RNP ופלסמיד GFP. פסי קנה מידה: 350 מיקרומטר. (D) אימות יעילות gRNA ב-hiPSCs על ידי ריצוף Sanger של DNA מוגבר מתאים חיוביים ל-GFP. לאחר פיצול מוצלח של הדנ"א הדו-גדילי, מסלולי הריצוף מראים אותות על גבי המתחילים מאתר המטרה של ה-gRNA (למעלה, KO1). במקרה של מיקוד לא מוצלח, מסלול רצף הדנ"א נשאר ללא שינוי (למטה, KO2) בהשוואה לבקרת LACZ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
איור 2: אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים. (A) איור סכמטי שמראה את זרימת העבודה עבור אלקטרופורציה של אורגנואידים בקליפת המוח האנושית (hCOs). ראשית, hCOs מחולקים לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר. יומיים לאחר מכן, תערובת RNP המכילה פלסמיד ביטוי GFP וירוק מהיר מוזרק לתוך לומן של מבנים דמויי חדרים, מועדף באזור החיצוני של hCOs. עבור electroporation, hCOs ממוקמים בתא electroporation. לאחר מספר ימים של תרבית, ניתן לזהות אות GFP באזורים מחושמלים. (B) תמונות של חתך ויברטומי של hCOs. האורגנואידים משובצים בנקודת התכה נמוכה של 3% בתווך בבלוק (משמאל). הגוש מחולק לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר (באמצע). האורגנואידים החתוכים מועברים חזרה לצלחת התרבית עם קצה פיפט רחב (מימין). (C) תמונות המראות את הזרקת התערובת המכילה את ה-RNP, pCAG-GFP ו-0.1% Fast Green לתוך מבנים דמויי חדרים של האורגנואידים. האורגנואידים שקועים בתמיסה של טיירוד ונימי הזכוכית הדקים מוחדרים בלומן של מרכז מבנים דמויי חדרים (משמאל). מלקחיים משמשים לייצוב האורגנואידים (שמאל ואמצע). החדרים בצד החיצוני של האורגנואידים ממוקדים (באמצע). אורגנואידים מוזרקים מועברים לתא האלקטרופורציה, או מאוחר יותר לצלחת התרבית, עם קצוות פיפט רחבים (מימין). (D) תמונות של תא האלקטרופורציה, המורכב מצלוחית פטרי מזכוכית ומשני להבי מתכת המודבקים לזכוכית. להבי המתכת משמשים כאלקטרודות ומכילים חורים לחיבור הכבלים לחיבור האלקטרופורטור. הצד המוזרק של hCO, הנראה דרך צל ירוק, צריך לפנות לאנודה (קוטב חיובי, כבל אדום) (מימין). (E) תמונות מייצגות של hCOs המציגות מבנים מפותחים דמויי חדרים. הטבעת הבהירה יותר מייצגת את האזור דמוי אזור החדר. העיגול הכהה יותר במרכז המבנה דמוי החדר מייצג את הלומן ויש לכוון אותו להזרקה. (F) תמונות מייצגות של hCOs חסרי מבנים דמויי חדרים מפותחים, שאנו ממליצים לא לכלול בניסויים נוספים. (G) תמונות מייצגות של hCOs לאחר הזרקת תערובת האלקטרופורציה, שבהן אזורים ממוקדים נראים באמצעות ירוק מהיר (חיצים כתומים). (H) תמונה מייצגת של hCO המראה אות GFP מקורי 24 שעות לאחר אלקטרופורציה. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> 
איור 3: ניתוח אימונוהיסטוכימי של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים אלקטרופורטים. (A) סכמטי המייצג אורגנואיד קליפת המוח האנושי המחושל (hCO) עם אות פלואורסצנטי ירוק. (B) צביעת DAPI (אפור) ואימונופלואורסנציה עבור GFP (ירוק) של hCO קריוסקציה עם חדרים מחושמלים מרובים, 7 ימים לאחר התחשמלות. (ג-ח) תמונות לדוגמה של תוצאות אלקטרופורציה שונות, מוכתמות עבור GFP (ירוק) וגרעינים (DAPI, אפור). (C) אלקטרופורציה אופטימלית עם גרעינים שלמים (ראה נספח 1, D), מבנה דמוי חדר ללא הפרעה, ותאים מחושמלים באזור הפונה כלפי חוץ האורגנואיד, שהוא בדרך כלל המורחב ביותר. (E) דוגמה ל-hCO המציג מוות תאי מסיבי באזור המחושל (ראה גם תוספת 2, D), המאופיין בגרעינים קטנים, צפופים ומעוותים. (F) אלקטרופורציה מוצלחת המכוונת לחלק הפנימי של האורגנואיד, שלעתים קרובות קשה יותר לפרש בגלל אזורים דמויי צלחת קליפת המוח המתמזגים עם חדרים סמוכים. (G) מבנים דמויי חדרים משובשים במרכז האזור המתחשמל (חץ כתום). (H) דוגמה ל-hCO המכיל מספר חדרים קטנים יותר שמתמזגים חלקית, ולכן קשה לכמת. (I) צביעת DAPI (אפור) ואימונופלואורסנציה עבור GFP (ירוק) ו-PCGF4 (מגנטה) 7 ימים לאחר אלקטרופורציה של קומפלקס RNP המכוון ל-LACZ (gLACZ KO, משמאל) או PCGF4 (gPCGF4 KO, מימין) לנוקאאוט בתיווך CRISPR/Cas9. תאים מעוגלים מדגישים את העוצמה המופחתת של PCGF4, מה שמצביע על אבלציה גנטית מוצלחת. אות אחיד ניתן לראות בפקד LACZ (משמאל). (J) הגרף מראה את עוצמת PCGF4 המכומתת לאחר אימונופלואורסנציה בתאים חיוביים ל-GFP עבור הבקרה (gLACZ KO) וה-KO של PCGF4 (gPCGF4 KO) ביחס לחציון ביטוי PCGF4 בתנאיg LACZ. כל נקודה מייצגת תא. נתונים מ 3-4 אורגנואידים משתי אצוות שונות (אפור ושחור) של אותו קו hiPSC. p &lt; 0.0001, מבחן מאן-ויטני. כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (B, C) או פלואורסצנטי (E-I) לסריקת לייזר. התמונות מייצגות הקרנות בעוצמה מרבית של ערימות z בעובי 10-15 מיקרומטר. קווים מקווקווים לבנים מציינים את המשטח האפי הפונה ללומן החדר ואת המשטחים החיצוניים של hCOs. קווים מקווקווים כתומים מציינים את גבול VZ/SVZ בחדרים ממוזגים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>נוגדן/צבע</td>
			<td>דילול</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עוף נגד GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכבר נגד PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 חמור נגד עוף</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 חמור נגד ארנב</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>דאפי</td>
			<td>1 מ"ג / מ"ל מלאי; 1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: רשימת נוגדנים וצבעים ודילולם המשמשים לצביעת Immunofluorescence.

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות...

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית של גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים במגוון תרביות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הטכניקה שימושית לבחינת תפקודים מולקולריים ופיזיולוגיים ספציפיים של נוירונים, כולל מנגנונים אוטונומיים של תאים ואינטראקציות בין חלבונים טרנססינפטיים.

אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות: טכניקה במבחנה להעברת פלסמידים בתוך נוירונים ממוקדים בפרוסות היפוקמפוס במוח

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר...

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.

מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: אקס-אוב גישת Electroporation

אנו מציגים שיטה המתארת בידוד ותרבית של צמחי שבלול מהאוזן הפנימית של עכבר עוברי.  אנו גם מדגימים שיטה להעברת גנים לתוך צמחי שבלול באמצעות אלקטרופורציה של גל מרובע. תרבית הצמח במבחנה יחד עם טכניקת העברת גנים מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינוי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

חקור מניפולציה גנטית באלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בתאי מקור עצביים ומנגנוני התפתחות מוח אנושית.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

גלה סרטונים נוספים