הערכת איתות מוות תאי על ידי אימונופלואורסצנציה במודל חולדה של שבץ איסכמי

שבץ איסכמי הוא הגורם המוביל למוות ונכות ברחבי העולם. העבודה שלנו מתמקדת במטרות תרופתיות לשבץ מוחי. אנו מעוניינים במספר מטרות מתפתחות, כגון RUNX1 וקתפסינים. כדי להעריך את המטרות הללו, פיתחנו מודל חולדה של שבץ איסכמי על ידי חסימת עורק המוח האמצעי.

אנו מודלים שבץ איסכמי בחולדות על ידי החדרת נימה כדי לחסום את עורק המוח האמצעי. מודל חסימת עורק המוח האמצעי הוא מודל המכרסמים הנפוץ ביותר למחקרי שבץ מוחי פרה-קליניים בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון TTC, אימונופלואורסצנציה וצביעה TUNEL. אנו יכולים לחקור את הפתופיזיולוגיה של שבץ מוחי בגישה משולבת. ישנם כמה אתגרים טכניים לאימונופלואורסצנטיות, כגון הספציפיות של נוגדנים, מזעור הרקע של הקרינה ואופטימיזציה של יחס האות לרעש על ידי רתימת התכונות של תוויות פלואורסצנטיות והנוגדנים הספציפיים. אימונופלואורסצנציה מאפשרת לנו להבין את הנוף המורכב של הארכיטקטורה התאית, ואת האינטראקציות המולקולריות עם מודל חסימת עורק המוח האמצעי.

מספר רקמות מוח ניתנות להצלה עם חלון זמן מתאים של השבץ. התוצאות שלנו מראות כי הביטוי של קטפסין B מופעל במספר מוחות החולדות לאחר חסימת עורק המוח האמצעי. זה מלווה באפופטוזיס מוגבר. מחקרים נוספים על המנגנון העומד בבסיס איתות מוות תאי עשויים להועיל למטרה חדשה לתרופה.

במחקר העתידי שלנו, נמשיך לחקור מטרות מולקולריות פוטנציאליות במסלולים דלקתיים ואיתות מוות תאי. אנו מקווים שחלק מהמטרות הללו שהתגלו במחקרים ניסיוניים יוכלו להיות מתורגמים לטיפול קליני, ובכך לשפר את ההישרדות ואת איכות החיים של חולי שבץ.

[קריין] כדי להתחיל, הנח את החולדה המורדמת במצב שכיבה ושמור על טמפרטורת גופה על 36.5 מעלות צלזיוס באמצעות שטיח חום מווסת ובדיקת ניטור טמפרטורת פי הטבעת. לגלח את העור בצוואר ולחטא אותו באמצעות תמיסת חיטוי יודופור. לאחר מכן, בצע חתך בקו האמצע של 2 ס"מ בצוואר והחזיר את הרקמות הרכות כדי לחשוף את כלי הצוואר. בעזרת מלקחיים, בודד את עורק הצוואר המשותף הימני, או CCA, עורק הצוואר החיצוני, ECA ועורק הצוואר הפנימי, ICA. קשר את ה-CCA הימני הפרוקסימלי באמצעות תפרים. לאחר מכן מהדקים את ה-ICA וה-ECA הנכונים במקורם עם מיקרוקליפ. הכנס מונופילמנט ניילון מצופה בקצה סיליקון עגול ללומן של ה-CCA דרך חתך קטן וקשר קשר ב-CCA כדי למנוע דימום ועקירה של המונופילמנט. פתח את המיקרוקליפ הימני של ICA והכנס את המונופילמנט לעורק המוח האמצעי הימני, או MCA, דרך גדם ה-ICA עד שקצה הסיליקון חוסם את מקור ה-MCA. חותכים את החלק החשוף של מונופילמנט הניילון וסוגרים את חתך הצוואר בקו האמצע. לאחר שעתיים של חסימת MCA, פתח את חתך הצוואר ושחרר את הקשר ב-CCA. לאחר מכן משוך את מונופילמנט הניילון כדי להחזיר את ה-MCA. לאחר הניתוח, התבונן בחולדה במהלך ההתאוששות מההרדמה בכלוב מחומם המתוחזק עם מחצלת חימום מווסתת טמפרטורה. באמצעות סולם הדירוג ההתנהגותי הארוך של זאיה, העריכו את התפקוד הנוירולוגי שעתיים לאחר חסימת עורק המוח האמצעי, או MCAO, ו-22 שעות לאחר רפרפוזיה. לאחר בידוד המוח כולו מחולדת מודל MCAO, הקפיאו את המוח בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. חותכים את המוח הקפוא לשש פרוסות עטרה עם מרחק של 2 מ"מ בין הפרוסות. מכתימים את הפרוסות ב-2% TTC למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך. ואז תקן את פרוסות המוח עם 4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. צלמו את הפרוסות המוכתמות באמצעות מצלמה דיגיטלית המוגדרת למצב אוטומטי עבור אובייקטי תקריב. העבירו את התמונות למחשב והשתמשו בתוכנת ImageJ כדי למדוד את גודל האוטם. חישבו את גודל האוטם כיחס בין סכום שטח האוטם בכל שש הפרוסות לסכום השטח הכולל במוח באותן פרוסות. אזורי אוטם משמעותיים נצפו בקבוצת MCAO בהשוואה ללא אוטם בקבוצת הדמה. לניתוח אימונופלואורסצנטי, תקן את המוח השלם מחולדת מודל MCAO ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות. לאחר מכן יש לייבש את המוח בסדרה של שיפועי תמיסת סוכרוז בריכוזים של 10%, 15% ו-30%, בריכוזים של 10%, 15% ו-30%, והמשיכו עד שהרקמה שוקעת. הטמע את המוח המיובש בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית והסר בועות אוויר. הצמד מקפיא את המוח בחנקן נוזלי. על קריוסטט, חתכו את המוח בעובי של 5 מיקרומטר. לאחר איזון חלקי המוח הקפואים בטמפרטורת החדר, יש לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS סטרילי למשך 5 דקות כל אחד. מתאר את הרקמה עם עט אימונוהיסטוכימיה לפני הדגירה עם 20 מיקרוגרם למ"ל של פרוטאינאז K ו-0.3% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר שטיפת החלקים עם PBS, יש למרוח 3% BSA על הרקמה המתוארת ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה לחסימה. החלף את תמיסת החסימה בנוגדנים הראשוניים המתאימים ודגר את החלקים למשך הלילה בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את החלקים שלוש פעמים עם PBS סטרילי המכיל 0.1% Tween-20 למשך 5 דקות כל אחד. הוסף את הנוגדן המשני המתאים המצומד לפלואורופור הנדרש ודגר את החלקים בתא לח למשך שעה, תוך הגנה עליהם מפני אור. לאחר שטיפת החלקים עם PBS המכיל Tween-20, יש לצבוע אותם באמצעי הרכבה המכיל DAPPI ולכסות בהחלקות כיסוי. במיקרוסקופ פלואורסצנטי, הגדר את אורך גל העירור ל-488 ננומטר, את אורך גל הפליטה ל-520 ננומטר ואת זמן החשיפה ל-500 אלפיות השנייה כדי ללכוד קטע מוח מוכתםהגילאים. התגובתיות החיסונית של קטפסין B הייתה מוגברת באופן משמעותי בליבה האיסכמית של קבוצת MCAO בהשוואה לקבוצת הדמה. התגובתיות החיסונית של קטפסין B הייתה מוגברת באופן משמעותי בקליפת המוח הפנומברה של קבוצת MCAO בהשוואה לקבוצת הדמה. לא נצפה הבדל משמעותי בתגובתיות החיסונית של קטפסין B בין הליבה האיסכמית לקליפת המוח הפנומברלית. כדי להתחיל, יש לייבש את פרוסות המוח הקבועות של פרפורמלדהיד מחולדת מודל MCAO בהגדלת ריכוז האתנול למשך 35 עד 50 דקות כל אחת. לאחר מכן טפל בפרוסות המוח בחומר ביולוגי שקוף מסוג שמן טרפנטין 1 למשך 35 עד 50 דקות, ולאחר מכן חומר ניקוי 2 למשך 35 עד 50 דקות עד שהרקמה שקופה לחלוטין. כעת טבלו פרוסות מוח בהטמעת מדיומים 1, 2, 3 ו-4 ברצף 60 דקות כל אחד. מניחים פרוסות מוח בקלטת הטמעה, אוטמים אותן היטב ומאחסנים אותן באחסון קר להתמצקות. בעזרת המיקרוטום, חותכים את גוש הרקמה ב-10 מיקרומטר ואז פורסים ב-5 מיקרומטר. הניחו לחלקי הרקמה לצוף באמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ולאחר מכן העבירו אותם למגלשות. לאחר הייבוש, יש להסיר את חלקי המוח בחומר ניקוי למשך שני מחזורים של 10 דקות כל אחד. לאחר מכן החזירו לחות לחלקי המוח בריכוזי אתנול יורדים. כעת שטפו את החלק שלוש פעמים ב- PBS למשך חמש דקות כל אחת. לאחר הסרת עודפי הלחות, מוסיפים 100 מיקרוליטר פרוטאינאז K לכל חלק ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר שטיפת PBS, יש למרוח 100 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל דאוקסי-נוקלאוטידיל טרנספראז על כל דגימה, ולדגור בתא לח ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות. הסר את המאגר באמצעות נייר סופג והוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לתיוג מערכת הבדיקה TUNEL. לאחר מכן, מרחו את תמיסת העבודה DAPPI על החלקים ודגרו בחושך למשך חמש דקות כדי להכתים את הגרעינים. שוטפים את הדגימות ב-PBS ארבע פעמים למשך 5 דקות כל אחת. הסר עודפי נוזלים ואטום את השקופית עם מדיום הרכבה נגד דהייה. סרוק את השקופית המוכתמת באמצעות מערכת ההדמיה הרב-ספקטרלית Vectra Polaris. צביעת TUNEL הראתה עלייה משמעותית באפופטוזיס, עם יותר תאים חיוביים ל-TUNEL בקליפת המוח הפנומברלית של קבוצת MCAO בהשוואה לקבוצת הדמה.