כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

המחקר שלנו מתמקד בניצול התכונות הייחודיות של הידרוג'ל גרגירי כדי לחקור את תנועת התאים ותפקודיהם להתחדשות רקמות. תגובת התא למיקרו-סביבה חשובה למודל בהבנת ההשלכות על השפעה תרגומית. ככל שהשימוש בפיגומי יציאה תלת מימדיים גדל, כך גדל הצורך במבחני הגירה תלת מימדיים מקיפים המשכפלים טוב יותר את התנהגות התאים בסביבת ריפוי פצעים.

פיתחנו שני צינורות תלת מימדיים, מפיתוח פיגומים ועד הדמיה וניתוח, לחקר תנועת תאים ונדידה במבחנה. עם שתי הבדיקות החדשות הללו, השגנו את היכולת לעקוב אחר התאים המגיבים בשני שלבים נפרדים של ריפוי פצעים: חדירה ראשונית של פיגום מרקמה בתפזורת ותנועת תאים ברגע שהם מוקפים בפיגום מורכב. כדי להתחיל, לוח 120,000 תאי פיברובלסטים עוריים אנושיים לסנטימטר רבוע לפחות בשש בארות של צלחת של 96 בארות.

לאחר דגירה של לילה, הסר את המדיה מבארות התא באמצעות שואב או פיפטה. הוסף את הצבע ב -20 מיקרוליטר מכל מצב ג'ל לבארות באמצעות פיפטה תזוזה חיובית. בעזרת חיבור צנטריפוגת רוטור מסתובב בצלחת המוגדר ל-25 מעלות צלזיוס, סובב את הצלחת ב-100 גרם למשך 15 שניות עם תאוצה והאטה מוגדרים ל-8 כדי לשטח את הג'ל.

הפוך את הצלחת 180 מעלות וסובב שוב כדי להבטיח פיזור ג'ל אחיד על פני קרקעית הבאר. כדי לצלם את הג'ל בצורה אספטית, הפעל אור ממוקד ב-365 ננומטר למשך 30 שניות כדי לחשל את הפיגום. לאחר יצירת כל הפיגומים, הוסיפו 200 מיקרוליטר מדיה לכל באר ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצלם את התאים וללכוד את התנהגות הנדידה שלהם. לניתוח תמונה, פתח את תוכנת המרת התמונות של Imaris להמרות אצווה. גרור ושחרר תמונות מיקרוסקופיה לתוכנת ההמרה ובחר תיקיה בזירת התוכנה כדי לייבא את הקבצים.

בחר כל קובץ בנפרד כדי להגדיר את גודל Voxel. לחץ על התחל הכל כדי להתחיל בהמרה. לאחר מכן, בתוכנת Imaris Arena, בחר תמונה מהזירה כדי להתחיל בעיבוד.

לחץ על הכרטיסייה Image Pros בסרגל הכלים הראשי. כעת, לחץ על התפריט הנפתח של ערוץ 1 ובחר חיסור ברקע. לחץ על אישור כדי לחזור לתצוגה התלת-ממדית.

בסרגל הכלים הקטן, לחץ על הסמל עם צורות כחולות מעוגלות עם התווית הוסף משטחים חדשים כדי ליצור כרטיסיית אובייקטים הניתנים לעריכה בשם משטחים 1. צור באופן ידני פרמטרים עבור כל השכפולים באמצעות לחצן החץ הכחול. הגדר את פרטי פני השטח ל- 0.7 מיקרומטר ובחר חיסור רקע, ניגודיות מקומית.

הזינו את אורך התא הממוצע בקוטר הכדור הגדול ביותר, המתאים לתיבת העצם. לצורך קביעת סף, קבעו את ההיסטוגרמה של העוצמה כדי לפלח רק את התאים הבהירים ביותר. הפעילו את Split Touching Objects, Region Growing וקבעו את קוטר נקודות הזריעה כך שיתאים לקוטר הקודם שנעשה בו שימוש.

כדי לשמור את פרמטרי היצירה לניתוח אצווה, לחץ על סמל השרביט שכותרתו יצירה. לחץ על פרמטרי האחסון עבור אצווה, תן שם לקובץ ולחץ על אישור. לאיסוף כל גבהי התאים, לחץ על הכרטיסייה מפורט. בחר ערכים ספציפיים ולאחר מכן מקם Z מהתפריטים הנפתחים.

לחץ על שמור סמל כדי לייצא את כל מיקומי Z והסיווגים לקובץ XLS. כדי להתחיל, שפכו PBS לצלחת פטרי מתחת למכסה המנוע הלמינרי ופיפטה טיפות של 20 מיקרוליטר של תמיסת המדיה התאית על המכסה ההפוך של צלחת הפטרי. הנח את המכסה בחזרה על הכלי ודגר את הצלחת לקבלת ספרואידים תלת מימדיים תלויים בתרבית טיפות.

כדי להגדיר את ה-PLOSMA, השתמש בפיפטה תזוזה חיובית כדי להוסיף באופן אספטי 15 מיקרוליטר של הג'ל לבארות של צלחת שקופה של 96 בארות. בעזרת חיבור צנטריפוגת רוטור מסתובב בצלחת, סובב את הצלחת ב-1, 000 גרם למשך 10 שניות כדי לשטח את הג'ל. הפוך את הצלחת 180 מעלות וסובב שוב כדי להבטיח פיזור ג'ל אחיד.

לאחר מכן, החל אור ממוקד ב-365 ננומטר למשך 30 שניות כדי לחשל את הפיגום וצילום את הג'ל מלמעלה. העבירו באופן אספטי את צלחת הפטרי של טיפות תלויות לתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה והפכו את המכסה. בעזרת פיפטה של 20 מיקרוליטר, שאפו לאט טיפה עד שהכדור נכנס לקצה הפיפטה והוציאו את הטיפה על הפיגום במרכז הבאר.

דגרו את צלחת הבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר לספרואידים להיצמד לפיגום. לאחר הדגירה, פיפטה 15 מיקרוליטר ג'ל נוספים על גבי כל ספרואיד. צנטריפוגה את הצלחת ב-300 גרם למשך 15 שניות לכל כיוון כדי להבטיח פיזור ג'ל אחיד.

חישול שכבת הג'ל העליונה לשימוש באור אולטרה סגול כפי שהודגם קודם לכן. הנח את הצלחת מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי ודמיין את הספרואידים לאחר בחירת מישורי ה-Z הנמוכים והגבוהים ביותר. לאחר ייבוא התמונות לתוכנת Imaris Arena, לחץ על התפריט הנפתח של ערוץ 1 ובחר חיסור ברקע.

לחץ על אישור בתחתית החלונית. בתצוגת תלת-ממד, לחצו על Auto Adjust All Channels בחלון הנפתח Display Adjustment ובצעו תיקונים לפי הצורך. בסרגל הכלים הקטן יותר, לחץ על הסמל Add New Reference Frame כדי ליצור כרטיסיה עם התווית Reference Frame 1.

העבר את המקור למרכז הכדור בכל שלושת המישורים. באותו סרגל כלים, לחץ על הסמל עם הכדורים הכתומים כדי להוסיף כתמים חדשים, צור כרטיסייה בשם Spots 1, ולחץ על כפתור החץ הכחול כדי להמשיך. לצורך קביעת סף, התאימו את היסטוגרמת העוצמה כדי לפלח רק את החלקים הבהירים ביותר.

השתמש בכלי הפריסה כדי לנווט באוסף התמונות לדיוק. לחץ על החץ הבא הכחול שלוש פעמים. בטל את הסימון של Render on Slicer או לחץ על סמל הריבוע הצהוב בחלונית ההתקנה.

לחץ על הכרטיסייה סטטיסטיקה. בתפריטים הנפתחים, בחר ערכים ספציפיים ומרחק ממסגרת ההתייחסות למקור. לחץ על הסמל שמור.

כדי לשמור את כל השינויים והניתוחים, לחץ על הסמל שמור בסרגל הכלים הראשי. שיטה זו שימשה להערכת חדירה תאית בממשק רקמות. המיקום החציוני בציר ה-Z של תאים נודדים גדל באופן משמעותי מאפס ל-24 שעות, מה שמעיד על תנועת תאים אנכית בולטת.

שינוי הקיפול בנדידת התאים לאורך ציר ה-Z הוכפל לאחר 24 שעות. תאים שנזרעו בשיטת PLOSMA הדגימו התפשטות ונדידה משמעותית מליבת הספרואיד לאחר 24 שעות. הדמיות תלת מימדיות הראו התפשטות תאים נרחבת בפיגום PLOSMA לאחר 24 שעות, עם הקרנות גלויות המשתרעות החוצה.

תמונות התלת מימד המעובדות באמצעות פונקציית הכתמים חשפו מיקומי תאים מפוזרים בפיגום, מה שמעיד על נדידה נרחבת. התאים עברו מרחק ממוצע של יותר מ-200 מיקרומטר עם תוצאות עקביות על פני דגימות. שינוי הקיפול בגובה Z של התאים בפיגום PLOSMA היה בערך 4, מה שמצביע על תנועה משמעותית כלפי מעלה.