הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

אנו חוקרים את המנגנון המולקולרי והתאי של העברה סינפטית באמצעות צומת נוירו-מסקולרי של דג זברה זחל כמערכת מודל. אנו מעוניינים להבהיר את המיתון הרגולטורי של הסינפסה בתגובה למצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מאפשר לנו לדמיין העברה חדשה המושרה על ידי פוטנציאל פעולה בצומת עצב-שרירי של דג זברה עם רגישות משופרת.

אנו יכולים לעקוב אחר התפקוד הסינפטי שנוצר על ידי גירוי מתון, שלא נבדק בעבר. פרוטוקול הדמיה זה יכול להתבצע תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונאלי ואינו דורש בהכרח מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. במילים אחרות, שיטה זו מספקת פלטפורמה חסכונית להדמיית תפקוד עצבי-שרירי בהשוואה למערכי ניסוי אחרים.

להכנת 200 מיליליטר מהתמיסה החוץ-תאית, מערבבים 6.4 מיליליטר של 3.5 נתרן כלורי מולרי, 0.4 מיליליטר של אשלגן כלורי מולארי אחד, 1 מיליליטר של HEPES מולרי אחד, 0.4 מיליליטר של סידן כלורי מולרי אחד, 0.2 מיליליטר של מגנזיום כלוריד מולארי אחד ו -360 מיליגרם גלוקוז. לאחר מכן הוסף מים טהורים במיוחד כדי להביא את הנפח הכולל ל-200 מיליליטר. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי D-tubocurarine של 15 מילי-מולרית להכנת 100 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית עם 3 מיקרו-מולרי D-tubocurarine.

להכנת 25 מיליליטר של התמיסה החוץ-תאית המכילה 0.02% טריקאין, הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת מלאי 1% טריקאין ל -25 מיליליטר תמיסה. בעזרת מושך מיקרו פיפטה, משוך את נימי זכוכית התטה עד שקוטר הקצה נמדד בטווח של 3 עד 10 מיקרומטר. מלאו את הפיפטה בתמיסה החוץ-תאית.

הכנס חוט פלטינה דק לכל פתח של הנימים, והחזק את אלקטרודת פיפטת זכוכית תטה על מחזיק הפיפטה של המיקרו מניפולטור הממונע. לאחר מכן חבר את הקצה האחורי של כל חוט למבודד הגירוי. עבור 25 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית המכילה 0.02% טריקאין לצלחת פטרי מזכוכית, העבירו זחלי דג זברה לצלחת פטרי לדיסקציה.

השתמש בשני מלקחיים עדינים כדי לקלף את עור הזחלים. השתמש במלקחיים הראשונים כדי להחזיק את הזחלים במקומם וצבט את העור בצד הגבי של שלפוחית השחייה עם המלקחיים האחרים. לאחר מכן בעזרת אזמל, הסר את שלפוחית השתן, האיברים הפנימיים והראש.

השתמש בפיפטה מזכוכית עם קצה מלוטש באש כדי להעביר את דגימת דג הזברה המנותחת לתא ההדמיה. תקן מכנית את הדגימה עם חוט ניילון המודבק לחוט פלטינה בצורת C כדי לכוון אותו בזווית מקבילה בערך לאלקטרודה המגרה. לחלחל את הדגימה באמצעות מערכת זרימת כבידה בקצב של 1 מיליליטר לדקה עם תמיסה חוץ-תאית המכילה 3 מיקרו-מולרי D-tubocurarine.

לאחר מכן, הכנס את אלקטרודת הגירוי לחוט השדרה. מקם בזהירות את קצה האלקטרודה ליד הנוירונים המוטוריים של עמוד השדרה, המזוהים כתאי עצב חיוביים ל-TagRFP הממוקמים בצד הגחון של חוט השדרה. קדם את האלקטרודה בזווית אלכסונית מהקטע הסמוך למצב המטרה.

כדי להתחיל במחשב, בחר את אזור ההדמיה בהתבסס על התמונה החיה של הקרינה של TagRFP. ודאו שהאזור שנבחר כולל בוטונים מרובים ואינו כולל את אלה הסמוכים לגבול מקטע הגוף. החלף את יחידת מסנן הקרינה GFP פלואור פלואורסצנטי להדמיה.

לאחר מכן, התאם את עוצמת מקור האור כדי לקבל תמונה בהירה במצב זמן-lapse של 1 הרץ ללא רוויה. הזן את זמן החשיפה ל-100 בשדה אלפיות השנייה של החשיפה של חלון המיקרו-מנהל. הגדר את תוכנת רכישת התמונות ואת התקן פלט הקלט הדיגיטלי כדי לסנכרן את רכישת התמונה עם גירוי חשמלי.

לאחר מכן, קבע את תדירות הגירוי, מספר פוטנציאל הפעולה ועיכוב הזמן בין תחילת רכישת התמונה למסירת הגירוי בסקריפט הארדואינו. על סמך הגדרות אלה, חשב את המספר הכולל של התמונות הנדרשות לרכישה והזן ערך זה בשדה הספירה של חלון הרכישה הרב-ממדית במיקרו-מנג'ר. הגדר מרווח של שנייה אחת בשדה המרווח עבור הדמיית קיטוע זמן של 1 הרץ.

לגירוי חשמלי, הגדר את מבודד הגירוי כך שיספק פולסים של מתח קבוע של אלפית שנייה של 70 מילי-וולט. בצע את פקודת הדיגיטייזר כדי להתחיל ברכישת תמונה. עקוב אחר התהליך כדי לוודא שאין סחיפה בלתי מקובלת של תמונה וכי ניתן לצפות בפלואור ובתגובות.

לשנות את עוצמת הגירוי, כגון תדירות במספר הפולסים, או להתאים את הטמפרטורה בהתאם למטרת הניסוי. שמרו את התמונות עם קיטועי זמן כערימת סדרות זמן של TIFF. סינפסות עם עליות אות גדולות נבחרו לניתוח, אם כי כל הבוטונים הראו שינויים ניתנים לזיהוי במצב פוטנציאל הפעולה של 20 הרץ 100, תגובות פלואור חזקות נצפו בגירוי חשמלי בתדר גבוה עם שינויים פלואורסצנטיים המצביעים על אקסוציטוזיס במהלך הגירוי והדעיכה שלאחר מכן, המשקפים אנדוציטוזיס והחמצה מחדש של שלפוחיות סינפטיות.

קבועי זמן דעיכת הקרינה השתנו עם גירוי, עוצמה וטמפרטורה עם פוטנציאל פעולה של 20 הרץ 25 המוצגים ב-16.6 שניות, פוטנציאל פעולה של 20 הרץ 100 ב-56.8 שניות, ופוטנציאל פעולה של 50 הרץ 500 ב-62.7 שניות.