Name: הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: חקור מנגנוני העברה סינפטית בצומת העצבי-שרירי של זחלי דג זברה באמצעות הדמיה חיה מבוססת pHluorin. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר פעילות סינפטית בתנאי גירוי שונים ביעילות עלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+presynaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vacuolar-type+h%2B+atpase-mediated+proton+influx+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles.</a> J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).</li>
<li>Egashira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+ph+dynamics+in+gabaergic+synaptic+vesicles+illuminates+the+mechanism+and+kinetics+of+gaba+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).</li>
<li>Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snare+function+analyzed+in+synaptobrevin%2Fvamp+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice.</a> Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).</li>
<li>Takamori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+anatomy+of+a+trafficking+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular anatomy of a trafficking organelle.</a> Cell. 127 (4), 831-846 (2006).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).</li>
<li>Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+regulates+the+kinetics+of+synaptic+vesicle+endocytosis+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons.</a> Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).</li>
<li>Voglmaier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytic+pathways+control+the+rate+and+extent+of+synaptic+vesicle+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling.</a> Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).</li>
<li>Balaji, J., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vesicle+imaging+reveals+that+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+are+coupled+by+a+single+stochastic+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).</li>
<li>Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+the+vesicular+gaba+transporter+to+functional+vesicle+pools+by+an+atypical+dileucine-like+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif.</a> J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+asynchronous+modes+of+synaptic+transmission+utilize+different+calcium+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources.</a> Elife. 2, e01206(2013).</li>
<li>Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatigue+in+rapsyn-deficient+zebrafish+reflects+defective+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release.</a> J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).</li>
<li>Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+synaptic+vesicle+release+at+neuromuscular+synapses+of+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tabares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+synaptic+function+at+the+neuromuscular+junction+of+a+mouse+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).</li>
<li>Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+luminance+and+contrast+by+linear+and+nonlinear+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina.</a> Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).</li>
<li>Almeida, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+induces+axonal+hotspots+of+synaptic+vesicle+fusion+that+promote+sheath+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth.</a> Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+dynamics+of+synaptic+vesicle+trafficking+and+fusion+at+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone.</a> eLife. 5, e13245(2016).</li>
<li>Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+newly+released+synaptic+vesicle+proteins+at+ribbon+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones.</a> iScience. 17, 10-23 (2019).</li>
<li>Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+dynamics+of+single+fused+synaptic+vesicle+proteins+from+a+single+ribbon+active+zone+in+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).</li>
<li>Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuromuscular+junction+research+prompted+by+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model.</a> Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).</li>
<li>Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+recycling+synaptic+vesicles+constitute+readily+releasable+vesicles+in+intact+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+synaptic+plasticity+in+acute+hippocampal+slices+maintained+in+a+small-volume+recycling-%2C+perfusion-%2C+and+submersion-type+chamber+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system.</a> J Vis Exp. (131), e55936(2018).</li>
<li>Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+axonal+outgrowth+of+identified+motoneurons+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).</li>
<li>Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Brehm, P., Wen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+neuromuscular+junction%3A+The+power+of+n%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Zebrafish neuromuscular junction: The power of n.</a> Neurosci Lett. 713, 134503(2019).</li>
<li>Ben Fredj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Mandal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+mitochondrial+transport+is+essential+for+organelle+distribution+and+health+in+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons.</a> J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+recycling+in+the+synaptic+bouton%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton.</a> Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).</li>
<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+ph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular ph.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מטרת טבילה במים 40x</td><td>אולימפוס</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>מערכת זלוף זרימת כוח משיכה 4ch</td><td>ALA</td><td>VCPlus-4G</td><td></td></tr><tr><td>5x אובייקטיביה</td><td>אולימפוס</td><td>NPLN5X</td><td></td></tr><tr><td>Custum עשה תא הדמיה</td><td>Physiotech</td><td>custum עשוי</td><td>צלחת אקרילית שחורה (קוטר 10.7 ס"מ, עובי 3 מ"מ) עם באר (קוטר 1 ס"מ בתחתית, קוטר 1.5 ס"מ בחלק העליון) מחזיקה כ-0.5 מ"ל פרפוזאט.&nbsp;</td></tr><tr><td>התקן קלט/פלט דיגיטלי</td><td>Arduino</td><td>Uno Rev3</td><td></td></tr><tr><td>D-Tubocurarine dichloride pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>93750</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office Professional Plus 2016</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י / imageJ</td><td>https://imagej.net/</td> <td>imageJ 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>AsOne</td><td>7-562-05 (Dumont #5)</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur פיפטה</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td>יש לקצץ את הקצה וללטש אותו באש עד שהקוטר הסופי הוא 1.5&ndash; 2 מ"מ.&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית</td><td>AsOne</td><td>1-4564-06</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Ver. 6.37</td><td></td></tr><tr><td>מחמם תמיסה מוטבע</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תאורת LED</td><td>X-cyte</td><td>XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Methylen blue</td><td>Wako</td><td>133-06962</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>Ver. 2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>מיני מהדק מגנטי לצינור זלוף</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-1553</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ממונע</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מדגם מטלטלת ממונעת</td><td>Scientifica</td><td>MMSP</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק פיפטה</td><td>Narishige</td><td>H-13</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>חוט פלטינה (&phi; 0.1 מ"מ)</td> <td>Nilaco</td><td>PT-351165</td><td></td></tr><tr><td>חוט פלטינה (&phi; 0.5 מ"מ)</td> <td>Niaco</td><td>PT-351381</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>AsOne</td><td>8-3086-02 (נוצה #11)</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת cMOS מדעית</td><td>Thorlabs</td><td>CC215MU</td><td></td></tr><tr><td>מלח ים</td><td>NAPQO</td> מיקרוסקופ סטריאו <td>אוקיינוס מיידי אולימפוס</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>גירוי מבודד</td><td>AMPI</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr><tr><td>צינור יניקה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>ST-3, 64-1406</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סאטר</td><td>נימי זכוכית</td><td>תטא BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין (MS-222)</td> <td>TCI</td><td>T0941</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

אם הדגימה המנותחת מוכנה ללא נזק חמור לרקמות, ואלקטרודת הגירוי מוחדרת כראוי לחוט השדרה, ניתן לעורר תגובת pHluorin חזקה על ידי גירוי חשמלי בתדר גבוה (איור 4D,E). הקרינה הבסיסית לפני הגירוי נבעה ככל הנראה מהגשושית הקיימת על פני השטח של הפרה-סינפסה. העלייה בקרינה במהלך הגירוי משקפת את השחרור האקסוציטוטי של הגשושית אל פני השטח. הדעיכה שלאחר מכן משקפת אנדוציטוזיס והחמצה מחדש של SVs המכילים בדיקה. מאפיינים אלה של הגשושית המבוססת על pHluorin תואמים היטב למחקרים קודמים במערכי ניסוי ש...

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

אנו חוקרים את המנגנון המולקולרי והתאי של העברה סינפטית באמצעות צומת נוירו-מסקולרי של דג זברה זחל כמערכת מודל. אנו מעוניינים להבהיר את המיתון הרגולטורי של הסינפסה בתגובה למצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מאפשר לנו לדמיין העברה חדשה המושרה על ידי פוטנציאל פעולה בצומת עצב-שרירי של דג זברה עם רגישות משופרת.אנו יכולים לעקוב אחר התפקוד הסינפטי שנוצר על ידי גירוי מתון, שלא נבדק בעבר. פרוטוקול הדמיה זה יכול להתבצע תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונאלי ואינו דורש בהכרח מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. במילים אחרות, שיטה זו מספקת פלטפורמה חסכונית להדמיית תפקוד עצבי-שרירי בהשוואה למערכי ניסוי אחרים.להכנת 200 מיליליטר מהתמיסה החוץ-תאית, מערבבים 6.4 מיליליטר של 3.5 נתרן כלורי מולרי, 0.4 מיליליטר של אשלגן כלורי מולארי אחד, 1 מיליליטר של HEPES מולרי אחד, 0.4 מיליליטר של סידן כלורי מולרי אחד, 0.2 מיליליטר של מגנזיום כלוריד מולארי אחד ו -360 מיליגרם גלוקוז. לאחר מכן הוסף מים טהורים במיוחד כדי להביא את הנפח הכולל ל-200 מיליליטר. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי D-tubocurarine של 15 מילי-מולרית להכנת 100 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית עם 3 מיקרו-מולרי D-tubocurarine.להכנת 25 מיליליטר של התמיסה החוץ-תאית המכילה 0.02% טריקאין, הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת מלאי 1% טריקאין ל -25 מיליליטר תמיסה. בעזרת מושך מיקרו פיפטה, משוך את נימי זכוכית התטה עד שקוטר הקצה נמדד בטווח של 3 עד 10 מיקרומטר. מלאו את הפיפטה בתמיסה החוץ-תאית.הכנס חוט פלטינה דק לכל פתח של הנימים, והחזק את אלקטרודת פיפטת זכוכית תטה על מחזיק הפיפטה של המיקרו מניפולטור הממונע. לאחר מכן חבר את הקצה האחורי של כל חוט למבודד הגירוי. עבור 25 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית המכילה 0.02% טריקאין לצלחת פטרי מזכוכית, העבירו זחלי דג זברה לצלחת פטרי לדיסקציה.השתמש בשני מלקחיים עדינים כדי לקלף את עור הזחלים. השתמש במלקחיים הראשונים כדי להחזיק את הזחלים במקומם וצבט את העור בצד הגבי של שלפוחית השחייה עם המלקחיים האחרים. לאחר מכן בעזרת אזמל, הסר את שלפוחית השתן, האיברים הפנימיים והראש.השתמש בפיפטה מזכוכית עם קצה מלוטש באש כדי להעביר את דגימת דג הזברה המנותחת לתא ההדמיה. תקן מכנית את הדגימה עם חוט ניילון המודבק לחוט פלטינה בצורת C כדי לכוון אותו בזווית מקבילה בערך לאלקטרודה המגרה. לחלחל את הדגימה באמצעות מערכת זרימת כבידה בקצב של 1 מיליליטר לדקה עם תמיסה חוץ-תאית המכילה 3 מיקרו-מולרי D-tubocurarine.לאחר מכן, הכנס את אלקטרודת הגירוי לחוט השדרה. מקם בזהירות את קצה האלקטרודה ליד הנוירונים המוטוריים של עמוד השדרה, המזוהים כתאי עצב חיוביים ל-TagRFP הממוקמים בצד הגחון של חוט השדרה. קדם את האלקטרודה בזווית אלכסונית מהקטע הסמוך למצב המטרה.כדי להתחיל במחשב, בחר את אזור ההדמיה בהתבסס על התמונה החיה של הקרינה של TagRFP. ודאו שהאזור שנבחר כולל בוטונים מרובים ואינו כולל את אלה הסמוכים לגבול מקטע הגוף. החלף את יחידת מסנן הקרינה GFP פלואור פלואורסצנטי להדמיה.לאחר מכן, התאם את עוצמת מקור האור כדי לקבל תמונה בהירה במצב זמן-lapse של 1 הרץ ללא רוויה. הזן את זמן החשיפה ל-100 בשדה אלפיות השנייה של החשיפה של חלון המיקרו-מנהל. הגדר את תוכנת רכישת התמונות ואת התקן פלט הקלט הדיגיטלי כדי לסנכרן את רכישת התמונה עם גירוי חשמלי.לאחר מכן, קבע את תדירות הגירוי, מספר פוטנציאל הפעולה ועיכוב הזמן בין תחילת רכישת התמונה למסירת הגירוי בסקריפט הארדואינו. על סמך הגדרות אלה, חשב את המספר הכולל של התמונות הנדרשות לרכישה והזן ערך זה בשדה הספירה של חלון הרכישה הרב-ממדית במיקרו-מנג'ר. הגדר מרווח של שנייה אחת בשדה המרווח עבור הדמיית קיטוע זמן של 1 הרץ.לגירוי חשמלי, הגדר את מבודד הגירוי כך שיספק פולסים של מתח קבוע של אלפית שנייה של 70 מילי-וולט. בצע את פקודת הדיגיטייזר כדי להתחיל ברכישת תמונה. עקוב אחר התהליך כדי לוודא שאין סחיפה בלתי מקובלת של תמונה וכי ניתן לצפות בפלואור ובתגובות.לשנות את עוצמת הגירוי, כגון תדירות במספר הפולסים, או להתאים את הטמפרטורה בהתאם למטרת הניסוי. שמרו את התמונות עם קיטועי זמן כערימת סדרות זמן של TIFF. סינפסות עם עליות אות גדולות נבחרו לניתוח, אם כי כל הבוטונים הראו שינויים ניתנים לזיהוי במצב פוטנציאל הפעולה של 20 הרץ 100, תגובות פלואור חזקות נצפו בגירוי חשמלי בתדר גבוה עם שינויים פלואורסצנטיים המצביעים על אקסוציטוזיס במהלך הגירוי והדעיכה שלאחר מכן, המשקפים אנדוציטוזיס והחמצה מחדש של שלפוחיות סינפטיות.קבועי זמן דעיכת הקרינה השתנו עם גירוי, עוצמה וטמפרטורה עם פוטנציאל פעולה של 20 הרץ 25 המוצגים ב-16.6 שניות, פוטנציאל פעולה של 20 הרץ 100 ב-56.8 שניות, ופוטנציאל פעולה של 50 הרץ 500 ב-62.7 שניות.

live-imaging-synaptic-vesicle-recycling-neuromuscular-junction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה...

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה השלד. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי סגמנטלי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של ​​כל סוג תא.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה...

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחקר מחזור שלפוחית סינפטית בצמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה המבטאים צ'נלרודופסין באמצעות צבע פלואורסצנטי. אור כחול מפעיל את הצ'אנלרודופסינים, גורם לזרימת סידן ולאקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית. הצבע משתלב בקרומים העצביים ומופנם במהלך אנדוציטוזה, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת. גירוי נוסף של אור כחול גורם לאקסוציטוזה ולשחרור צבע, אשר מוצג על ידי פלואורסצנטיות מופחתת.

ניתוח מחזור שלפוחית סינפטית וקליטת צבע פלואורסצנטי בזחלי דרוזופילה

מקור: Schramm, P. et al. הדמיה in vivo של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלים וצעירים של דג זברה ער על ידי הסרת גולגולת ועור. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נוירונים במוח הקטן בזחלי דג זברה טרנסגניים, המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בנוירונים של פורקיניה. התהליך כולל הרדמת הזחלים, שיתוקם באגרוז והסרה זהירה של העור הפיגמנטי כדי לשפר את חדירת האור ועוצמת הקרינה. לבסוף, הדגימות המוכנות מצולמות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמיין את הנוירונים המסומנים בבירור.

הדמיה in vivo של מוח זחל דג הזברה להדמיית נוירונים במוח הקטן

מקור: Lukasz, D., et al. הדמיית סידן in vivo של תאי שיער בקו הרוחב בדג זברה זחל. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים הדמיה חיה של זרם סידן בתאי השיער בקו הצדדי של זחל דג זברה טרנסגני משותק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. גירוי מכני של צרורות שיער באמצעות פולסים נוזליים גורם לכניסת סידן דרך תעלות מכניות ותעלות מגודרות מתח, אשר מוצגות בזמן אמת באמצעות מחווני פלואורסצנטיות. השיטה מדגישה את הדינמיקה של סידן אפיקלי ובסיסי בתאי שיער נוירומסטים, ומבהירה את תפקידם בזיהוי תנועת מים.

הדמיית דינמיקת סידן בתאי שיער בקו הרוחב של דג זברה זחל

דג זברה היא מערכת מודל יש תכונות רבות ערך כולל בהירות אופטית, התפתחות חיצוני מהירה,, חשוב במיוחד בתחום השמיעה ושיווי, מבחוץ ממוקם תאי שיער חישה. מאמר זה מתאר כיצד הטרנסגניים דג זברה יכול לשמש כדי assay שיער-תא mechanosensation ותפקוד presynaptic בוססו.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

חקור מנגנוני העברה סינפטית בצומת העצבי-שרירי של זחלי דג זברה באמצעות הדמיה חיה מבוססת pHluorin. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר פעילות סינפטית בתנאי גירוי שונים ביעילות עלות.

הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

גלה סרטונים נוספים