הערכת פגוציטוזיס מיקרוגליאלי של פסולת מיאלין במבחנה תחת גירוי מגנטי חוזר

[מדריך] היקף המחקר שלנו מתמקד במחקר בשיקום נוירולוגי וטיפול בסימולציה מגנטית. פרוטוקול זה יכול לספק רעיונות חדשים לגירוי מגנטי בחקירת האופן שבו הוא משפיע על תפקוד ברור. נתמקד בשיקום נוירולוגי וטיפול בגירוי מגנטי בעתיד.

[מדריך] כדי להתחיל, השג ראש ערוף של חולדה נקבה. מנתחים את הראש על קרח. בעזרת מספריים, חתכו את הגולגולת כדי לחשוף את המוח במלואו ולהקל על הסרתו המלאה. השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לכרות בקפידה ובאספטיות את הממברנות, המוח הקטן וההיפוקמפוס. נקו את המוח שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר שאריות דם או רקמה. העבירו את המוח הנקי ל -10 מיליליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית מולרית של 0.32. בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים, חותכים את רקמת המוח לחתיכות לקבלת תערובת רקמת מוח-סוכרוז. לאחר מכן, העבירו את תערובת רקמת המוח והסוכרוז להומוגניזטור סטרילי של 50 מיליליטר. הוסף 30 מיליליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית מולרית 0.32. השתמש בהומוגנייזר זכוכית של 50 מיליליטר כדי לטחון את הרקמה למשך שתי דקות. כדי להשיג רקמת מוח חלקה הומוגנית. יש לדלל את רקמת המוח ל-90 מיליליטר עם תמיסת סוכרוז סטרילית של 0.32 מולאר, ולערבב היטב. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת סוכרוז סטרילית מולרית 0.83 לשישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה סטריליים בעלי קירות דקים. לאחר מכן מוציאים לאט 15 מיליליטר מתערובת המוח לחלק העליון של הצינורות. מיישרים את הנפחים עם תמיסת סוכרוז סטרילית מולרית 0.32. כדי לאסוף את פסולת המיאלין הגולמית, ראשית יש לקרר מראש ולאולטרה צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה של הדגימה ב-75,000 גרם למשך 45 דקות, ולאחר מכן אספו את פסולת המיאלין מהממשק בין שתי צפיפויות הסוכרוז באמצעות פיפטת מרעה סטרילית. להפרדה וטיהור איזוטוני ראשון, העבירו את תמיסת פסולת המיאלין שנאספה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. כוונן את עוצמת הקול ל -35 מיליליטר עם PBS סטרילי מקורר מראש, והעביר לצינור הומוגנייזר חדש. לאחר הומוגניזציה של שלוש דקות, יש לפזר את פסולת המיאלין באופן שווה בשישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה סטריליים של 38.5 מיליליטר. הרכיבו את הנפח בעזרת PBS סטרילי, ואז צנטריפוגה. להפרדה וטיהור איזוטוני שני, השעו מחדש את הגלולה הלבנה המוצקה ב-10 מיליליטר של PBS סטרילי מקורר מראש כדי לקבל תרחיף פסולת מיאלין. מחלקים את המתלה לצינורות אולטרה-צנטריפוגה כמו קודם, וצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה הלבנה המוצקה בשישה מיליליטר PBS סטרילי. חלקו את תרחיף פסולת המיאלין לשישה צינורות צנטריפוגה 1.5, ושוב צנטריפוגה. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של PBS סטרילי מקורר מראש לאחר השלכת הסופרנטנט. הפשירו את פסולת המיאלין הנדרשת בארבע מעלות צלזיוס, או במי קרח, וצנטריפוגות כמו קודם למשך 10 דקות. השעו מחדש את פסולת המיאלין ב-200 מיקרוליטר של תמיסת CFSE של 50 מיקרו-מולרי. דגרו את המתלה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות, ואז צנטריפוגה שוב. השליכו את הסופרנטנט, ואז שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי. השעו מחדש את פסולת המיאלין ב-100 מיקרוליטר של PBS סטרילי מקורר מראש כדי לקבל תרחיף של פסולת מיאלין המסומנת פלואורסצנטית. אחסן את הדגימה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לגירוי מגנטי חוזר במבחנה, הגדר את תדירות הטיפול ל-20 הרץ, את עוצמת הטיפול ל-1% מעוצמת הפלט המקסימלית ואת זמן הגירוי לחמש שניות. כלול תקופת מנוחה של 20 שניות, ומתן 600 פולסים על פני זמן טיפול יחיד של 2.5 דקות. לאחר קביעה מראש של פרמטרי הגירוי המגנטי, קבע את כיוון הסליל בניצב לקרקע וכוון אותו כלפי מעלה. עקר את סליל הגירוי המגנטי באלכוהול כדי למנוע זיהום תאים. לאחר הוספת 50 מיקרו-טוחנות של CFSE, צלחו 1,000 תאי BV-2 ב-24 צלחות באר למשך הלילה, ואז שאפו את המדיום הישן בעזרת פיפטה, והוסיפו מיד מדיום טרי ללא סרום. שנה את המדיום למדיום נטול סרום, וטפל בתאים במיקרוגרם אחד למיליליטר ליפופוליסכריד למשך 12 שעות. לאחר 12 שעות של התערבות ליפופוליסכריד, הוסף 100 מיקרוגרם למיליליטר של פסולת מיאלין למדיום לתרבית משותפת בחושך. חשוף את התאים לגירוי מגנטי חוזר, כפי שהודגם קודם לכן. ריססו אלכוהול על הצלחת כדי לעקר אותה לפני החזרתה לחממה. לאחר תקופה של תרבית משותפת עם שברי מיאלין, שטפו בעדינות שאריות מיאלין שאינן נספגות עם PBS. תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו לבארות 150 מיקרוליטר PBS המכילים 10% אלבומין בסרום חמור ו-0.3% טריטון X-100 ודגרו. לאחר שטיפת הבארות ב-PBS, הוסיפו תמיסת נוגדנים ראשונית ביחס של 100 עד 200 לבארות, ודגרו בקור. לאחר מכן, דגרו את התאים בנוגדנים משניים ביחס של 100 עד 300 למשך שעתיים בטמפרטורת החדר לפני הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי. תאי מיקרוגליה BV-2 הראו ירידה משמעותית בפגוציטוזיס של פסולת מיאלין לאחר טיפול בליפופוליסכריד. אשר התהפך על ידי התערבות חוזרת ונשנית של גירוי מגנטי. ניתוח כמותי אישר ירידה משמעותית בשטח פסולת המיאלין בתוך תאי BV-2 בקבוצת הליפופוליסכריד בהשוואה לקבוצת הביקורת, עם עלייה ניכרת בקבוצת הגירוי המגנטי שטופלה בליפופוליסכריד. אחוז המיקרוגליה החיובית ל-IBA-1 במיקום משותף עם פסולת מיאלין היה נמוך משמעותית בקבוצת ה-LPS בהשוואה לקבוצת הביקורת, בעוד שגירוי מגנטי הגדיל משמעותית את האחוז הזה. נצפתה עלייה תלוית זמן בפגוציטוזיס מיקרוגליאלי כאשר הקבוצה שטופלה בליפופוליסכריד עם גירוי מגנטי עבור הקבוצה שלנו הראתה ספיגת פסולת מיאלין גבוהה יותר באופן משמעותי.