הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר
11 באפריל 2025
פרוטוקול זה, המיועד למשתמשים מתחילים ברקמת האוזן הפנימית של העכבר, מפרט באופן מקיף שלבים לעיבוד אוזניים פנימיות של עכבר בשלבי התפתחות שונים לצביעה חיסונית של חתך.
המחקר שלי מתמקד בהתפתחות הנוירולוגית של השבלול. באופן ספציפי, אני שואף לחשוף את המנגנונים הבסיסיים של היווצרות SNAPS בתוך השבלול ולחקור את הקשר בין מחלת אלצהיימר לאובדן שמיעה. הדמיה חיה וכלים גנטיים משפרים את היכולת שלנו לחקור מבנים שבלוליים ומעגלים עצביים בפירוט רב יותר, ומספקים תובנות עמוקות יותר לגבי החוסן והתפקוד הלקוי של מערכת האודיטור. על-ידי פרסום הפרוטוקול הזה, אנחנו רוצים לעזור לחוקרים חדשים במדע האודיטור, במיוחד לאלה שלא עבדו עם שבלול לפני כן. מדריך זה מסביר צעד אחר צעד כיצד להכין דגימות אוזן פנימית מעכברים עובריים, יילודים ובוגרים. המטרה שלנו היא להקל על ניסויי האוזן הפנימית, ולהבטיח שהתוצאות אמינות ועקביות. לצביעה חיסונית בחתך יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות, כמו צביעה חיסונית שלמה. הוא משמר היטב חלבונים וחומצות גרעין, ויוצר חתכים דקים, כמעט דו-ממדיים, מה שהופך את המדידות למדויקות ועקביות יותר. שיטה זו גם שומרת על כל סוגי תאי השבלול שלמים וגלויים, ומשפרת את פולחן הצביעה החיסונית. בניגוד לתכשירים שלמים, חתך משמר מבנים חשובים, כמו הרצועה הספירלית, סטריה וסקולריס, קרום רייסנר והקרום הטקטוריאלי.
[מדריך] כדי להתחיל, הנח את העכבר הצעיר שעבר המתת חסד על פלטפורמה כירורגית. בעזרת מספריים לחיתוך עדין, בצע בזהירות חתך בקו האמצע לאורך הקרקפת, החל מהצוואר ונמשך לכיוון החוטם. לאחר מכן, הניחו את הלהב התחתון של המספריים במגנום הנקב, ואת הלהב העליון בגולגולת. חותכים את החצי העליון של הגולגולת עד האף כדי להשלים את החיתוך השני. החזר את המספריים מהראש החתוך חלקית. הנח את הלהב התחתון של המספריים בתחתית הגולגולת, ואת הלהב העליון בפורמן מגנום. חותכים את החצי התחתון של הראש עד האף כדי להשלים את החיתוך השלישי. בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים, נתק בזהירות את כל הרקמות הרכות המקיפות את העצם הטמפורלית, כולל המוח, השרירים ורקמת החיבור. לאחר מכן, הנח את חצאי ראשי העכבר לבארות של צלחת בת 24 בארות המכילה PBS. החלף את ה- PBS בתמיסת פרפורמלדהיד 4% לקיבוע ודגירה למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע יש לשטוף את הרקמה שלוש פעמים למשך חמש עד 10 דקות עם PBS. אתר את העצם הטמפורלית או קפסולת האוזן הפנימית בתוך חצי ראש העכבר. בעזרת מלקחיים עדינים, נתק בזהירות את הרקמה הרכה המקיפה את קפסולת האוזן הפנימית. לאחר השחרור, חתכו את הרקמה סביב קפסולת האוזן הפנימית. לאחר מכן הפעל לחץ עדין על האזור המקיף את קפסולת האוזן הפנימית באמצעות מלקחיים כדי לשחרר אותה לחלוטין. אחסן את דגימות האוזן הפנימית ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, הנח את העכבר הבוגר שהומת על פלטפורמה כירורגית. בעזרת מספריים חדים, בצע חתך בקו האמצע לאורך הקרקפת, החל מהצוואר ונמשך לכיוון החוטם. קפלו את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת במהלך החתך הראשון. הנח את הלהב התחתון של המספריים במגנום הנקב, ואת הלהב העליון בגולגולת. חותכים את החצי העליון של הגולגולת עד האף כדי להשלים את החיתוך השני. החזר את המספריים מהראש החתוך חלקית. מקם את הלהב התחתון בבסיס הגולגולת, ואת הלהב העליון במגנום הנקב. חותכים את החצי התחתון של הראש עד האף לאורך קו האמצע, והימנעו מהאוזניים הפנימיות. עבור כל חצי ראש, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לנתק רקמות רכות המקיפות את העצם הטמפורלית, כולל המוח, השרירים ורקמת החיבור. לאחר מכן, סלסל לאחור את רקמת הגולגולת באצבעות והשתמש באגודל כדי להפעיל לחץ עדין על החלק התחתון של העצם הטמפורלית. שחרר בהדרגה את העצם מהחיבורים הסובבים אותה. לאחר הסרת קפסולת האוזן הפנימית, שטפו אותה היטב עם PBS. מניחים מתחת למיקרוסקופ צלחת סילגארד מלאה ב-4% פרפורמלדהיד. מקם קפסולת אוזן פנימית אחת בצלחת. בדוק את האוזן הפנימית לאיתור רקמות רכות או עצם מחוברות, והסר אותה בעדינות. זהה את החלון הסגלגל והסר בעדינות את הסטפס באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים עדינים, פתח חור קטן בקודקוד השבלול. בעזרת פיפטה P20 מלאה ב-4% פרפורמלדהיד, שטפו את השבלול כדי להבטיח שנוזלים, כמו דם מדולל או אנדולימפה, יעברו דרך החלון הסגלגל. העבירו את השבלול הקבוע לצלחת של 24 בארות מלאה ב-4% פרפורמלדהיד. סמנו את הזמן ודגרו במשך 30 עד 60 דקות בתסיסה עדינה בעזרת נדנדה או נוטר. לאחר הדגירה, שטפו את הדגימה שלוש פעמים למשך חמש עד 10 דקות עם PBS. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו את השבלול ב-EDTA של 1.25 מילי-מולרית והניחו לו להתנדנד במשך יומיים-שלושה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר טיפול ב-EDTA, שטפו את השבלול שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS. כדי להתחיל, הניחו את קפסולת האוזן הפנימית המנותחת בתמיסת סוכרוז של 10%, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה יש להחליף את תמיסת הסוכרוז 10% ב-20% סוכרוז ולדגור למשך שעתיים נוספות. לאחר מכן החלף את תמיסת הסוכרוז של 20% ב-30% סוכרוז ודגר את הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסר מחצית מתמיסת הסוכרוז של 30%. מלאו את החלל בטמפרטורת חיתוך אופטימלית או בתרכובת OCT ותנו לדגימה להתנדנד למשך 30 דקות עד שעתיים. העבירו את הדגימות לתבניות קריו-מסומנות מלאות בתרכובת OCT. בדוק את כיוון השבלול בקריובלוק המוטבע. ודא את האוזן הפנימית; הצד הקעור פונה לצדדים הצרים של הקריותבנית לחתכי שבלול סטנדרטיים. לאחר מכן, הניחו קרח יבש בכלי קטן והוסיפו חמישה עד 10 מיליליטר דימתילבוטן. הנח את תבניות הקריו-תבניות המכילות OCT ואת הדגימה על הקרח היבש המבעבע כדי להקפיא במהירות את הבלוק. העבירו את הבלוקים לחדר של קריוסטט מקורר מראש למינוס 20 מעלות צלזיוס. אפשר לדגימות להתייצב למשך 30 עד 60 דקות. בעזרת עיפרון או עט, סמנו את הצד של בלוק הקריו המתאים למיקום השבלול כדי להבטיח כיוון נכון לחיתוך. לאחר מכן, הוסף מאגר קטן של OCT לצ'אק והנח עליו את בלוק הקריו, וודא שהצד הרחב ללא סימן העיפרון פונה כלפי מטה. הנח את הצ'אק המכיל את ה-OCT ואת הדגימה בתא הקריוסטט המצונן, ואפשר ל-OCT לקפוא לחלוטין. לאחר מספר דקות, מקם את הצ'אק עם הדגימה על מחזיק הצ'אק כשסימן העיפרון מצביע ימינה או שמאלה. בקריוסטט, חתוך את הבלוק באמצעות הגדרה של 40 מיקרומטר עד שהרקמה מתגלה. לאחר שהרקמה נראית לעין, קצרו קטע של 12 מיקרומטר באמצעות שקופיות המיועדות להקפאה. בדוק את מיקום הקטע במיקרוסקופ. אם אתם מתקרבים לסיבובי השבלול, המשיכו לקצור מקטעים של 12 מיקרומטר, ובדקו מעת לעת את המיקום עד שכל סיבובי השבלול נחתכו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים לעיבוד רקמת אוזן פנימית של עכבר בשלבי התפתחות שונים לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית של חתכים. מטרתו לסייע לחוקרים מתחילים בתחום מדעי השמיעה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- מדעי השמיעה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- השבלול (cochlea) הוא קריטי לשמיעה והתפתחותו הנוירולוגית חיונית לתפקוד השמיעתי.
- הבנת המבנים בשבלול עשויה להשפיע על ההבנה של מצבים כגון מחלת אלצהיימר ואובדן שמיעה.
- צביעה אימונוהיסטוכימית של חתכים רוחביים מציעה יתרונות על פני שיטות של דגימות שלמות (whole-mount), תוך שימור מבנים תאיים חשובים.
- פרוטוקול זה נועד עבור חוקרים המתחילים לעבוד עם רקמות של השבלול.
מטרת המחקר
- לפישוט תהליך הכנת דגימות של האוזן הפנימית מעכברים.
- להבטחת תוצאות מהימנות ועקביות בניסויי צביעה אימונוהיסטוכימית.
- לספק מדריך מקיף לחוקרים מתחילים במדעי השמיעה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ה diseection (הסרה והפרדה) של רקמות האוזן הפנימית בעכבר בשלבים התפתחותיים שונים.
- קיבוע של דגימות ב-paraformaldehyde לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית.
- חיתוך של דגימות האוזן הפנימית לחתכים רוחביים לצורך ניתוח מפורט.
- שימוש בתמיסות סוכרוז להגנה קריוגנית (cryoprotection) לפני הטמעה בתרכובת OCT.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של דגימות אוזן פנימית מעכברים בשלבי עובריים, יילודים ומבוגרים.
- דיוק ועקביות משופרים במדידות הודות לצביעה אימונוהיסטוכימית של חתכים רוחביים.
- שימור מבני השבלול, המשפר את איכות הצביעה האימונוהיסטוכימית.
- מתן הדרכה לחוקרים מתחילים להקל על ביצוע ניסוייהם.
מסקנות
- הפרוטוקול מסייע ביעילות בהכנת רקמות של האוזן הפנימית של עכבר למטרות מחקר.
- צביעה אימונוהיסטוכימית של חתכים רוחביים היא טכניקה בעלת ערך לחקר מבני השבלול.
- מדריך זה מהווה משאב משמעותי עבור חוקרים חדשים בתחום השמיעה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
חיתוך קריוסיקציות וצביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטיים של רקמות האוזן הפנימית בעכברים מאפשרים ניתוח בעלי נאמנות גבוהה של סוגי תאים בשבלול לאורך שלבי התפתחות שונים, ובכך תומכים במחקרים מכניסטיים בביולוגיה של השמיעה. פרוטוקול זה מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובבדיקת מסלולים למחקר על אובדן שמיעה וניוון עצבי. הכנה אמינה של רקמות בשלבים עובריים, ניאונטליים ושלב הבגרות מחזקת את הרצף התרגומי ואת קבלת ההחלטות לגבי פורטפוליו פיתוח תרופות לשמיעה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר לוקליזציה וכמימות מדויקים של ביטוי חלבונים במבנים של השבלול (cochlea).
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי שימור כל סוגי התאים בשבלול לצורך ניתוח מקיף.
- מסייע בבדיקה מונחית-השערות של נתיבי התפתחות השמיעה ומסלולי מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק חיתוכי רקמה דקים וניתנים לשחזור עבור בדיקות צביעה אימונוהיסטוכימיות כמותיות.
- ממסד את הכנת הדגימות, ובכך מפחית שונות ומשפר את היכולת להשוות בין הבדיקות.
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור סריקה והערכה של תרכובות בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה מידה עם מודלים רלוונטיים למחלות לצורך חקר של תפקוד שמיעתי לקוי וניוון עצבי.
- שומר על השלמות המבנית של אזורי מפתח בשבלול, ובכך תומך בגילוי סמנים ביולוגיים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לאישור פרה-קליני במודלים של עכברים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לתיקוף מודלים פרה-קליניים במחקרי שמיעה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערת האפס ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי אפשור ניתוח תאי מפורט.
- סריקה: מספקת חיתוכי רקמה הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, עבור תוצרי צביעה אימונוהיסטוכימית כמותית.
- אנליטיקה: מספקת קריאות עקביות ובאיכות גבוהה להשוואת ביטוי חלבונים בין תנאים ושלבים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי שימור מבנים קוכלאריים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך עבודה סטנדרטי וניתן להרחבה, המותאם לתוכניות מחקר שמיעיות מגוונות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות שמיעתיות.
- ערך תפעולי: מקדם הדירות, סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה בזרימות עבודה של עיבוד רקמות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go ויעילות הון על ידי אפשור יצירת נתונים חסונים חוצי-שלבים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסי מחקר שמיעתיים.
שיקולים ליישום
- דורש מיומנות בטכניקות של דיסקציה עדינה וחיתוך קריוגני (cryosectioning) להשגת איכות דגימה אופטימלית.
- נדרשת גישה לקריוסטט, לחומרי הטמעה ולנוגדנים מאושרים לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית.
- נדרש סטנדורטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות והשוואתיות של התוצאות.
- ניתן להתאמה למודלים של עכברים עובריים, ילודיים ובוגרים, תוך שימת לב לאנטומיה של השבלול (cochlear anatomy).
- שלמות הדגימה ועקביות הצביעה האימונוהיסטוכימית תלויות בטיפול זהיר ובהקפדה על הפרוטוקול.
שאלות נפוצות על ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:39
Mouse Embryonic and Juvenile Inner Ear Sample Collection and Dissection for Cryosectioning
3:36
Adult Mouse Inner Ear Sample Collection and Dissection with EDTA Treatment for Cryosectioning
6:24
Cryosectioning of Juvenile and Adult Mice Inner Samples for Immunostaining
