בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר
31 בינואר 2025
פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.
אנו חוקרים תיקון ריאות לאחר זיהום ויראלי. אנו שואפים להבין את המנגנונים שבאמצעותם תאי חיסון מתווכים תיקון אפיתל וכיצד עיצוב מחדש לאחר פגיעה ויראלית ותיקון לאחר מכן יכול להשפיע על פתולוגיות מחלה עתידיות. פרוטוקול זה מטפל בחוסר ההתאמה של עיכול ריאות המותאם לתאי אפיתל וסטרומה או לתאי חיסון.
המחקר שלנו דורש בידוד תאים ברי קיימא מתאים חיסוניים ולא חיסוניים. יתר על כן, הצגנו אסטרטגיית שער עבור תת-קבוצות אפיתל ומקרופאגים, שאנו מקווים שתועיל לתחום. המעבדה שלנו חוקרת את הדיבור ההדדי בין תאי חיסון ותאי אפיתל בדרכי הנשימה בתנאי מצב יציב ובתגובה לאתגרים סביבתיים.
המטרה הסופית שלנו היא לקבוע כיצד לווסת את התקשורת הזו בצורה הטובה ביותר כדי לשפר את תיקון הרקמות ולמנוע התפתחות מחלות. כדי להתחיל, יש לרסס את העכבר באתנול 70%. בעזרת מספריים כירורגיים עדינים ומלקחיים מספר שבע, בצע חתך לתוך הבטן וחתוך לרוחב דרך הצפק.
בצע חתך קטן בסרעפת כדי לשחרר את הוואקום. לאחר מכן, חתכו את הסרעפת ואת כלוב הצלעות התחתון מחלל הגוף כדי לחשוף את הריאות והלב. בעזרת מזרק של 10 מיליליטר המצויד במחט בגודל 27, חדרו את הריאות בחמישה מיליליטר של שני מילי-מולרי EDTA ב-DPBS.
חותכים אנכית דרך עצם החזה ולאורך הצדדים כדי לפתוח את כלוב הצלעות ולחשוף את קנה הנשימה. השתמש במספריים עדינים ובמלקחיים מספר שבע כדי להסיר כמה שיותר שרירים ורקמות חיבור מבלי לנקב את קנה הנשימה או הריאות. לאחר מכן, עטפו את קנה הנשימה בתפר 2/0, ומקמו אותו כאילו כדי לקשור אותו, אך אל תהדקו.
צור חתך רוחבי בקנה הנשימה והכנס את הקטטר. לאחר מכן, משוך את התפר בחוזקה כדי להדק את הקטטר במקומו. נפח את הריאות במיליליטר אחד של DPBS באמצעות מזרק.
לאחר מכן, משוך לאט לאחור את המזרק כדי לשלוף את ה-DPBS. נפח מחדש את הריאות עם אותם DPBS, ושוב, משוך לאחור את המזרק כדי לאסוף את נוזל שטיפת הסימפונות, או BAL. נתק את המזרק מהקטטר תוך השארת הצנתר מוכנס.
הוצא את השסתום שנאסף לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, מלאו את אותו מזרק מיליליטר אחד במיליליטר אחד של דיספאז. חבר את המזרק לקטטר ונפח את הריאות בדיספאז.
בזמן הסרת הקטטר, הדק את התפר סביב קנה הנשימה כדי למנוע דליפה של דיספאז. בעזרת מספריים חותכים לרוחב דרך קנה הנשימה. הסר את הריאות מחלל הגוף על ידי חיתוך רקמת החיבור לאורך החלק האחורי של כלוב הצלעות תוך משיכת הריאות וקנה הנשימה כלפי מעלה.
לאחר מכן, הסר את הלב מהריאות. הניחו את הריאות בחמישה מיליליטר DPBS על קרח. שסתום צנטריפוגה ב -400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בעזרת פיפטה, שאפו את הסופרנטנט והשעו את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של RPMI. כדי להתחיל, נתחו את חמש אונות הריאות שנקטפו מהעכבר והשליכו את רקמת החיבור. קוצצים את רקמת הריאה המנותחת במספריים למשך דקה על מגלשת זכוכית.
בעזרת מספריים לדיסקציה, העבירו את רקמת הריאה הקצוצה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של תערובת עיכול ושפכו את תערובת עיכול הריאות למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש. לבסוף, הוסף את כדור התא שהתאושש מ-BAL שהושעה ב-RPMI.
הנח את הצינור בזווית של 45 מעלות בשייקר מסלולי המוגדר ל-140 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. לאחר הדגירה, הוציאו את הצינור מהשייקר והניחו אותו על קרח. פיפטה את תערובת עיכול הריאות למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים.
מסננים את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. שטפו את כל התאים שנותרו דרך המסנן ונטרלו את האנזימים עם 10 מיליליטר של 5% FBS במדיום RPMI. צנטריפוגה את הדגימה ב-600 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאפו את הסופרנטנט באמצעות שואב ואקום. השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר ליזה ACK ודגרו במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי ליז כדוריות דם אדומות. לאחר מכן, הוסיפו תשעה מיליליטר PBS ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה.
שוב, צנטריפוגה את הדגימה והשתמש בשואב ואקום כדי להסיר את הסופרנטנט, ואז השהה מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי. סנן את המתלה דרך רשת של 64 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה לניתוח ציטומטריית זרימה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את בידודן של אוכלוסיות תאים חיים, חיסוניים ולא-חיסוניים, מראתו של עכבר במצב בסיסי (steady state) ואחרי הדבקה בשפעת. הפרוטוקול מספק אסטרטגיות הגדרה (gating strategies) לזיהוי תתי-אוכלוסיות של תאי אפיתל ותאי מיאלואיד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- המחקר מתמקד במנגנוני תיקון הריאה לאחר זיהום נגיפי.
- הבנת תפקידם של תאי מערכת החיסון בתיקון אפיתליאלי היא קריטית.
- המחקר מתייחס לאתגרים הכרוכים בבידוד תאים חיוניים ממחיצות שונות של הריאה.
- בודק את האינטראקציות בין תאי מערכת החיסון לתאים אפיתליאליים בדרכי הנשימה.
מטרת המחקר
- בידוד תאים חיסוניים ולא-חיסוניים חיוניים מריאות של עכברים.
- פיתוח אסטרטגיית gating לזיהוי תתי-אוכלוסיות תאים ספציפיות.
- בחינת ההשפעה של פגיעה וריפוי נגיפיים על פתולוגיות עתידיות של מחלות.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של אוכלוסיות חיים חיסוניות ולא-חיסוניות מריאת עכבר.
- אסטרטגיות Gating לזיהוי תתי-אוכלוסיות של תאי אפיתל ותאי מיאלואיד.
- ניתוח מנגנוני תיקון של הריאה לאחר זיהום שפעת.
- הערכת השפעיות ההדדיות (crosstalk) בין תאים חיסוניים לתאי אפיתל.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אוכלוסיות תאים חיסוניים ולא-חיסוניים נפרדות.
- זיהוי של תתי-קבוצות ספציפיות של תאי אפיתל ומקרופאגים.
- תובנות לגבי מנגנוני תיקון הריאה בעקבות זיהום נגיפי.
- תרומה להבנת פתולוגיות של מחלות עתידיות הקשורות לפגיעה בריאה.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את היכולת לחקור תגובות חיסוניות בריאות
- הוא מספק כלים בעלי ערך לבחינת מנגנונים של תיקון אפיתל
- הממצאים עשויים להנחות מחקרים עתידיים על מחלות נשימה
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בידוד סימולטני של אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיטלייליים חיים מריאת עכבר מאפשר בחינה מקיפה של תקשורת בין-תאית במודלים של מחלות נשימתיות. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חיזוי בשלבי תיקוף המטרה ובשלבים מוקדמים של הגילוי. השיטה משפרת את קבלת ההחלטות בניהול תיקי פיתוח על ידי אספקת תרחיפי תאים בודדים רב-פרמטריים באיכות גבוהה לצורך אנליזות המשך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מחקר ישיר של אינטראקציות אימונו-אפיתליאליות הקריטיות לתיקוף מטרות במודלים של מחלות ריאה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להערכה פונקציונלית של תאים אימונולוגיים ותאים שאינם אימונולוגיים כאחד.
- מקל על בחינה מונחית-השערה של מסלולי תיקון ושינוי מבני (remodeling) לאחר פגיעה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תרחיפי תאים בודדים שעברו תיקוף ומתאימים לזרימה ציטומטרית ולתהליכי סינון מבוססי FACS.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה באמצעות סטנדרטיזציה של בידוד תאים באוכלוסיות חיסוניות ואפיתליאליות.
- מאפשר אסטרטגיות gating כמותיות לזיהוי חסון של תתי-אוכלוסיות תאים הן במצב נאיבי והן במצב פתולוגי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של עכברים הרלוונטיים למחלות לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים במחקר נשימתי.
- תומך ברציפות מהגילוי המכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח תגובות ספציפיות לתאים לזיהום או לפגיעה.
- מפחית עמימות ביולוגית במודלים פרה-קליניים על ידי לכידה של אוכלוסיות תאים מגוונות במסגרת תהליך עבודה יחיד.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ותומכת בתהליכי עבודה החל מתיקוף מטרה ועד לזיהוי מועמדים תרופתיים (leads) במודלים של מחלות דרכי הנשימה.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בחינה של היפותזות על תקשורת בין מערכת החיסון לרקמה האפיתלית והבנת מסלולים בתיקון הריאות.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של תתי-אוכלוסיות של תאים עבור סריקה גנטית או של תרכובות בשלבים הבאים.
- אנליטיקה: מספקת פלטי flow cytometry רב-פרמטריים לצורך ניתוח השוואתי בין תנאי מחלה לבקרות.
- מחקר תרגומי: מחברת בין ממצאים מכניסטיים לנקודות קצה פרה-קליניות במודלים של זיהום, אלרגיה, פיברוזיס וסרטן.
- שימוש חוזר ברמה המוסדית: קובעת פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה, הניתן להתאמה בין תוכניות מחקר שונות בתחום הנשימה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות ריאה.
- ערך תפעולי: מייעל את בידוד התאים, משפר את השחזוריות ותומך בניתוח בסביבת תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אפשור יצירת נתונים רב-פרמטריים חסונים בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מטרות ומודלים לצורך קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח ריאות עכבר, עיכול אנזימטי וניתוח באמצעות ציטומטריה זרימתיות.
- דורש גישה למכשור FACS ותשתיות אנליטיות לביצוע gating רב-פרמטרי.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לאסטרטגיות gating ולפרוטוקולים של טיפול בדגימות.
- ניתן להשמיט למספר מודלים של עכברים למחלות נשימתיות, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור נקודות סוף ספציפיות.
- חיוניות התאים והתנובה תלויות בביצוע מדויק של שלבי הדיסוציאציה האנזימטית והמכנית.
