מודל תכנות מחדש של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים לבדיקות חוץ גופיות

המחקר שלנו חקר את שושלת המונוציטים והמקרופאגים, תוך שימת דגש על הפלסטיות המדהימה שלו ויכולתו לשלב אותות מרובים מהסביבה כדי לעצב את תגובת האפקטור במהלך דלקת, תיקון רקמות וזיהומים. מקרופאגים נמצאים בכל הגוף ומתאמים את ההתחלה והפתרון של החסינות המולדת והמותאמת המשפיעה על הפתולוגיה המוגנת והמתווכת על ידי מערכת החיסון. תכנות מחדש של מקרופאגים הוא התכונה המבטיחה ביותר בתחום זה.

טכנולוגיית אומיקס מתפתחת חוללה מהפכה בהבנתנו את הביולוגיה של המקרופאגים, וסיפקה תובנה לגבי המגוון הפנוטיפי שלהם, המאפיין הפונקציונלי, פוטנציאל התכנות שלהם והמקור ההתפתחותי של תאים אלה. המכשול והמלכודת העיקריים בגילוי התמיינות וקיטוב מקרופאגים הוא תנאי הניסוי והפרוטוקולים ההטרוגניים בספרות והיעדר קונצנזוס בהגדרת מונח המקרופאגים. אנו מדגימים את השפעת התכנות מחדש של מתווך תרופות ושומנים על קיטוב מקרופאגים ומפתחים מודל תלת מימדי במבחנה של אינטראקציה בין תאי מקרופאג וגליובלסטומה.

בנוסף, הראינו כי טסיות הדם מעניקות רישיון להתמיינות המקרופאגים שמקורם במונוציטים לפנוטיפ N1. כדי להתחיל, הנח דגימות דם היקפיות נוגדות קרישה בצנטריפוגה. סובב אותו ל -200 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

שימו לב להפרדה של פלזמה עשירה בטסיות דם למעלה וחלק התאים, כולל תאי דם אדומים ולבנים, למטה. לדלל את השבר הסלולרי המתקבל מהצנטריפוגה הראשונה עם PBS סטרילי שחומם מראש לטמפרטורת החדר. הומוגניזציה עדינה של התמיסה לפני שתמשיך בצנטריפוגה של שיפוע צפיפות Ficoll-Hypaque.

העבירו 15 מיליליטר של Ficoll-Hypaque לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. הוסיפו בזהירות ובאטיות 30 מיליליטר דם מדולל על גבי ה-Ficoll, מה שמבטיח ערבוב מינימלי בין השלבים. צנטריפוגה הצינור המכיל את ה-Ficoll ודם מדולל ב-600G למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.

בעזרת פיפטה פסטר סטרילית של שלושה מיליליטר, הסר חלק מהשכבה העליונה הצהובה. אוספים בזהירות את הממשק בין השכבה הצהובה לשכבת הפיקול בעזרת פיפטה פסטר סטרילית. העבירו את התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי שנאספו, או PBMCs, לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר המכיל לפחות שלושה מיליליטר של PBS סטרילי.

מלאו את הצינור ב-PBS סטרילי כדי להגיע לנפח כולל של 12 עד 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-600G למשך 10 דקות. לאחר מכן, סובב את מתלה ה-PBMC ב-300G למשך חמש דקות ב-8 עד 10 מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את התאים בנפח הרצוי של PBS קר סטרילי עם 2% FBS. שמור את התאים על 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא. העבירו את הנפח הרצוי של מתלה PBMC לצינור תחתון עגול מפוליסטירן בנפח חמישה מיליליטר.

לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של קוקטייל בחירה חיובית על כל 100 מיקרוליטר של מתלה תאים. מערבבים היטב את המתלה לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של ננו-חלקיקים מגנטיים לכל 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים.

פיפטה נמרצת למעלה ולמטה יותר מחמש פעמים כדי להבטיח השעיה אחידה של הננו-חלקיקים המגנטיים. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוסף PBS המכיל FBS ו-EDTA למתלה כדי להפוך את הנפח הכולל ל-2.5 מיליליטר. פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש.

הכנס את הצינור לממיין המגנטים, ותן לו לעמוד ללא הפרעה במשך חמש דקות. הפוך את המגנט יחד עם הצינור בתנועה רציפה אחת. שמור את המגנט והצינור הפוכים למשך שתיים-שלוש שניות לפני החזרתם למצב זקוף.

הסר את הצינור מהמגנט ולאחר מכן הוסף שוב 2.5 מיליליטר של מאגר PBS-FBS-EDTA לתוך הצינור. פיפטה בעדינות את מתלה התא למעלה ולמטה פעמיים-שלוש כדי לערבב אותו. הכנס את הצינור בחזרה למגנט, והפריד אותו למשך חמש דקות.

בתנועה רציפה אחת, הפוך שוב את המגנט והשפופרת, והשליך את השבר העל. הסר את הצינור מהמגנט, והשהה מחדש את התאים בנפח מתאים של PBS-FBS ללא EDTA. התאים שנבחרו באופן חיובי מוכנים כעת לשימוש.

כעת הוסף מאגר PBS-FBS לתאי CD14 הממוינים, מה שהופך את הנפח הכולל ל-12 עד 14 מיליליטר כדי לדלל את כל ה-EDTA שנותר. צנטריפוגה בחום של 600 גרם למשך 10 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את המונוציטים CD14 שנבחרו באופן חיובי בשני מיליליטר של מאגר PBS-FBS.

ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. שמור את התאים על הקרח עד להכנת התרבית. לצורך תרבית, יש להשעות מחדש את הגלולה בריכוז של מיליון תאים למיליליטר במדיום RPMI 1640 בתוספת מדיום.

פיפטה 250 מיקרוליטר של מתלה התאים המוכן לכל באר של צלחת 48 בארות. הוסף 250 מיקרוליטר של מדיום RPMI בתוספת אנטיביוטיקה המכיל 50 ננוגרם למיליליטר של גורם מגרה מושבת מקרופאגים לכל באר. דגרו את צלחת תרבית התאים בחממה לחה כדי ליזום התמיינות מקרופאגים.

ביום הרביעי של התמיינות המקרופאגים, החלף מחצית ממדיום התרבות מכל באר. הוסיפו ציטוקינים או ריאגנטים לתנאי הקיטוב הרצויים, והמשיכו בתרבית במשך שלושה ימים נוספים. קצרו את המונוציטים שמקורם במקרופאגים ביום השביעי לאפיון פנוטיפי.

מקרופאגים M1 המושרים על ידי אינטרפרון גמא-פלוס ליפופוליסכריד הראו את הביטוי הגבוה ביותר של CD64, היעדר CD206 ורמות נמוכות של CD163 ו-MERTK. מקרופאגים M2a המושרים על ידי אינטרלוקין 4 התאפיינו בביטוי מוגבר של CD206, וירידה ברמות CD64, CD163 ו-MERTEK. מקרופאגים M2c המושרים על ידי אינטרלוקין 10 או דקסמתזון הראו ביטוי מוגבר של CD163 ו-CD14, רמות ביניים של CD64 ועלייה בביטוי MERKT.