זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה
2 במאי 2025
Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.
פיתחנו פרוטוקול חזק שבו ניתן לבצע מספר סבבים של הכלאה באתרה על אותו מוח דרוזופילה, המאפשר הדמיה של דפוסי הביטוי של גנים רבים ושונים. הטמעת מוח הזבוב בהידרוג'ל מבטיחה שלמות רקמה מצוינת ויציבות mRNA לאורך מספר סבבים של הכלאה. זה גם משפר משמעותית את הבהירות האופטית בעת הדמיה.
EASI-FISH יכול להיות מאומץ על ידי כל מעבדה עם מיקרוסקופ קונפוקלי או יריעת אור כדי להגדיר פרופילי ביטוי גנים של סוגי תאים במוח הזבוב. כדי להתחיל, נגב שקופית לא טעונה עם מגיב טיהור RNA. הסר את הסרט האטום המגן על הדבק מאטם הסיליקון.
לאחר מכן הדביקו את האטם המכיל עד ארבעה תאים למגלשה. השתמש בפיפטה P20 כדי לצפות כל משטח תא במיקרוליטר אחד של פוליליזין. לאחר מכן, העבירו עד ארבעה מוחות של דרוזופילה לכל שפופרת לתוך צינור PCR של 0.2 מיליליטר.
החזר לחות למוח ב-150 מיקרוליטר של PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 ואחריו PBS. הוסף 40 מיקרוליטר PBS לכל תא. בעזרת זוג פינצטה עדינה, מקם בעדינות את המוחות בשורה במרכז החדר, והשאיר מרווח ביניהם.
הסר PBS מהתא והוסף מיד 50 מיקרוליטר של מאגר MOPS של 20 מילי-מולרי. בזמן שהמוחות מאזנים במאגר MOPS, פיפטה נפחים שווים של Melphalan-X מופשר לתוך צינור עם מאגר MOPS בנפח שווה. לאחר מכן הוסף פתרון מלאי Ac-X ביחס של אחד ל-100.
מערבל את התמיסה וסובב אותה בקצרה כדי לאסוף אותה. הסר את כל חוצץ ה-MOPS מהתאים והוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת Melphalan-X Ac-X. הנח החלקת כיסוי על גבי כל תא מבלי להשתמש בדבק האטם לאיטום.
לאחר מכן הניחו את החדר בקופסה לחה. למחרת, הסר בזהירות את פתק הכיסוי ושאף את תמיסת Melphalan-X Ac-X. שטפו את המוחות המותקנים פעמיים ב -100 מיקרוליטר של 0.1% PBT, ואחריהם 100 מיקרוליטר PBS.
הניחו תמיסות מופשרות של TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED ואמוניום פרסולפט על קרח. מערבולת את פתרון TREx-1000 כדי להבטיח שאין משקעים. מערבבים את התמיסות להכנת תמיסת ג'ל ומערבולת לפני הציפוי.
בעזרת קצה פיפטה, הוציאו את ה-PBS מהתא ופתלו את כל הנוזלים שנותרו בעזרת מגבון נטול מוך. הוסף מיד 40 מיקרוליטר תמיסת ג'ל על המוח בכל חדר. דגרו את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
כעת הסר את תמיסת הג'ל מהתא. לאחר מכן קלף את סרט המגן השקוף מדבק משטח האטם. הוסף 45 מיקרוליטר אחרונים של תמיסת ג'ל טרייה.
הנח בעדינות פתק כיסוי מעל החדר ולחץ על החלקת הכיסוי כדי לאטום את החדר לפני הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות. דגרו את החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות כדי לפלמר את הג'ל. לאחר קירור הג'לים על ספסל, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר בזהירות את החלקת הכיסוי ואת אטם הסיליקון.
חותכים את הג'ל לצורה מלבנית וחותכים את הפינה הימנית העליונה כדי לציין את כיוון הדגימה. לאחר מכן, השתמש במברשת צבע עדינה שהורטבה בכמות קטנה של מאגר Pro K כדי להרים בזהירות את הג'לים מהשקופית. העבירו כל ג'ל בנפרד לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר.
מערבבים 500 מיקרוליטר של מאגר Pro K וחמישה מיקרוליטרים של אנזים Proteinase K, ומוסיפים את התערובת לכל ג'ל. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הסר את המאגר בעזרת פיפטה גמישה עדינה ולאחר מכן שטוף את הג'לים שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות כל אחד.
דגרו את הג'לים למשך 30 דקות במיליליטר אחד של מאגר DNASE1 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 מיקרוליטר של אנזים DNASE1 עם 450 מיקרוליטר של מאגר DNASE1. מערבבים בעדינות ללא מערבולת.
דגרו כל ג'ל ב -500 מיקרוליטר של תמיסת DNASE1 למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הג'לים ארבע פעמים למשך 15 דקות עם מיליליטר PBS בטמפרטורת החדר. כעת, דגרו את הג'לים ב-500 מיקרוליטר של מאגר הכלאה מופשר ללא בדיקות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
מדללים את הבדיקות במאגר הכלאה ביחס של אחד ל -100, מכינים 300 מיקרוליטר לג'ל. דגרו את הג'לים עם מאגר הכלאה המכיל בדיקות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הג'לים תחילה במאגר שטיפת בדיקה, ואז ב- PBS.
לתגובת שרשרת ההכלאה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הגברה לג'ל ודגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מחממים את סיכות השיער הפלואורסצנטיות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות במכונת PCR ומצננים את התמיסה ל-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עבור כל בדיקה, יש לדלל זוגות סיכות ראש תואמים ביחס של אחד ל-50 במאגר הגברה, ולהכין 300 מיקרוליטר לג'ל.
לאחר מערבולת התערובת, מוסיפים את התערובת לג'לים ודוגרים. כדי להרכיב את הג'ל להדמיית יריעות קלות, מצפים את משטח חיבור הג'ל של מחזיק ג'ל פעמיים במיקרוליטר אחד של פוליליזין, ומניחים לו להתייבש ב-37 מעלות צלזיוס בין שכבות. לאחר מכן, הניחו את הג'ל על החלקת כיסוי כך שהחתך יהיה בצד שמאל.
בעזרת מכחול מעבירים את הג'ל על המשטח המטופל בתנועה אחת. גנים הקשורים למוליכים עצביים וגנים נוירופפטידים הראו דפוסי ביטוי מובהקים במוח הדרוזופילה הבוגר. VGluT ו-Gad1 זוהו באותו סבב הכלאה, והראו דפוסי ביטוי לא חופפים.
AstA הראה ביטוי חזק באונה האופטית וביטוי חלש יותר בקומפלקס המרכזי. Crz התבטא מאוד ב-pars lateralis, בעוד שרמות ביטוי נמוכות יותר נצפו בתאי עצב של האונה האופטית. Tk זוהה בתאי עצב H דלתא D שזוהו עם ביטוי Mer-GFP באמצעות קו GAL4 מפוצל ספציפי על ידי יריעת אור או מיקרוסקופיה קונפוקלית.
FMRFamide נעדר בתאי עצב PFG המסומנים על ידי Mer-GFP, אך זוהה בתאי עצב שמסביב. הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים FB4K אישרה את ההתפלגות המרחבית של תעתיקי VGluT ו-ChAT/VAChT. נוירופפטידים, כגון AstA ו-Crz, מתבטאים כל כך חזק בתאים מסוימים עד שלא ניתן עוד להפריד כתמים פלואורסצנטיים בודדים המייצגים תעתיקים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג את שיטת Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH), טכניקה חדשנית המשלבת מיקרוסקופיית התרחבות (expansion microscopy) עם היברידיזציה פלואורסצנטית במקום (fluorescence in situ hybridization) לצורך תצפית על ביטוי גנים ברקמות עבות. השיטה מותאמת למערכת העצבים המרכזית של Drosophila, ומאפשרת לחוקרים להדמות דפוסי ביטוי של גנים מרובים בסוגי תאים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביטוי גנים
- ביולוגיה של התא
רקע
- מיקרוסקופיה של הרחבה מאפשרת בהירות אופטית ורזולוציה משופרות בדימות של רקמות עבות.
- הibrדיזציה פלואורסצנטית באתר (Fluorescence in situ hybridization) היא שיטה עוצמתית לזיהוי ביטוי גנים.
- השילוב של טכניקות אלו משפר את היכולת לנתח ארכיטקטורה רקמתיות מורכבת באורגניזמי מודל.
- Drosophila משמשת כמודל בעל ערך להבנת התפתחות עצבית ותפקוד גנים.
מטרת המחקר
- לפירוט פרוטוקול חזק המאפשר מספר סבבים של היברידיזציה של RNA in situ.
- לאפשר ויזואליזציה מקיפה של ביטוי גנים במוח של Drosophila.
- לספק מסגרת עבודה שניתן לאמץ בקלות במעבדות שונות הצומדות לכלי מיקרוסקופיה בסיסיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המחקר עושה שימוש בטכניקת שימוץ (embedding) בתוך הידרוג'ל כדי לשמר את שלמות הרקמה במוחות של Drosophila.
- המודל הביולוגי המרכזי כולל את מערכת העצבים המרכזית השלמה של Drosophila, תוך התמקדות בביטויים שונים של גנים נוירונליים.
- במאמר לא מוזכרים תהליכי עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- המאמר כולל פרוטוקולים מפורטים לעיבוד רקמות, היברידציה והדמיה.
- התוצאות תוקפו באמצעות אנליזות השוואתיות של ביטוי מרחבי תוך שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית או במיקרוסקופיית לוח אור (light sheet microscopy).
תוצאות עיקריות
- נדגמו דפוסי ביטוי מובחנים עבור גנים הקשורים למוליכים עצביים ולנוירופפטידים במוחות של Drosophila.
- ממצאי דוגמה כוללים ביטוי שאינו חופף של VGluT ו-Gad1, מה שמרמז על תפקידים שונים בהולכה עצבית.
- נוירופפטידים כגון AstA ו-Crz הראו רמות ביטוי גבוהות באזורים עצביים ספציפיים, במקביל להשלכות תפקודיות.
- שיטה זו מאפשרת מיפוי מדויק של ביטוי גנים לאורך שכבות תאיות ותורמת להבנת הקשרים בין מבנה לתפקוד של נוירונים.
מסקנות
- EASI-FISH מהווה התקדמות משמעותית בוויזואליזציה של ביטוי גנים ברקמות מורכבות.
- המחקר מדגיש את השימוש המשלימי בטכניקות דימוי שונות כדי לספק תובנות לגבי תפקוד גנים עצביים.
- ההשלכות משתרה על שיפור ההבנה של מנגנונים עצביים, עם יישומים פוטנציאליים בביולוגיה התפתחותית ובנוירוגנטיקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי רב-ערוצי (Multiplexed) של ביטוי גנים ברקמות עצביות שלמות הוא יכולת קריטית לגילוי מוקדם ותיקוף מטרות בפיתוח תרופות הממוקד בביולוגיה של מערכת העצבים. פרוטוקול EASI-FISH מאפשר זיהוי בסבירה גבוהה וברזולוציה גבוהה של עשרות תמלילי RNA במוח של Drosophila, ובכך תומך בניתוחים השוואתיים חסונים ומפחית את עלויות הרכיבים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בביטוי גנים ספציפי לסוגי תאים, ומסייעת בקבלת החלטות לגבי הפחתת סיכונים מכניסטיים וסדר עדיפויות בתיק הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מקיפה של דפוסי ביטוי גנים על פני תתי-סוגים של תאי עצב ותאי גליאה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ויזואליזציה של התפלגות תמלילים מרחבית ברזולוציה של מולקולה בודדת.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לגילוי מרובה (multiplexed) במעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות ותיעדוף שלהן בתהליכי עבודה של נוירוגנטיקה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות רקמה רב-ערכיות (multiplexed) ותקופות לצורך סריקות המשך ובדיקות פנוטיפיות.
- מסטנדרט את תנאי הבדיקה על ידי הטמעת מספר מוחות בכל ג'ל, מה שמאפשר השוואה ישירה של משתנים ניסויים.
- מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של ביטוי גנים להערכה אמינה של תרכובות.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות פורמולציית ג'ל חסונה והכלאה (hybridization) איטרטיבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מיישר בין מיפוי ביטוי גנים לבין גילוי ביומרקרים תרגומיים במודלים של רקמה עצבית.
- שומר על רצף מהשלבים המוקדמים של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוחים בסביבה של תפוקה גבוהה (High-throughput) המותאמים לסוגי תאים ספציפיים.
- מפחית את הסיכון הביולוגי בפיתוח תרכובות נוירו-אקטיביות על ידי הבהרת המעורבות של מטרה (target engagement) בהקשרי רקמה מורכבים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטת EASI-FISH משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישוש מטרות מוקדם, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר תרגומי בנוירוביולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות מיפוי ביטוי גנים מרובה (multiplexed) in situ.
- סריקה: מספק מערכות רקמה הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה לצורך הערכה כמותית של מודולציה גנטית.
- אנליטיקה: מאפשר רזולוציה של תמליל בודד (single-transcript) וכימות מרחבי להשוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי התאמת נתוני ביטוי גנים למעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולהתאמה לניתוח ביטוי גנים מרובה במודלים נוירוביולוגיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות עצביות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והתפוקה בזרימות עבודה של ביטוי גנים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מנומקת של go/no-go ובקידום יעיל של תיק השקעות מבחינת הון.
- השפעה על תיק ההשקעות: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות ותרכובות נוירו-אקטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית או במיקרוסקופיית light sheet ובטכניקות של היברידיזציה in situ.
- נחוש גישה לתשתיות דימוג חזקות ולריאגנטים זמינים מסחרית.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור הכנת ג'ל ופרוטוקולי היברידיזציה.
- ניתן להתאמה למערכות מודל אחרות באמצעות אופטימיזציה של תנאי הג'ל והפרובים.
- התפוקה והמולטיפלקס (multiplexing) מוגבלים על ידי קיבולת הדימוג ומגבלות בתכנון הפרובים.
