זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה
May 2nd, 2025
Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.
פיתחנו פרוטוקול חזק שבו ניתן לבצע מספר סבבים של הכלאה באתרה על אותו מוח דרוזופילה, המאפשר הדמיה של דפוסי הביטוי של גנים רבים ושונים. הטמעת מוח הזבוב בהידרוג'ל מבטיחה שלמות רקמה מצוינת ויציבות mRNA לאורך מספר סבבים של הכלאה. זה גם משפר משמעותית את הבהירות האופטית בעת הדמיה.
EASI-FISH יכול להיות מאומץ על ידי כל מעבדה עם מיקרוסקופ קונפוקלי או יריעת אור כדי להגדיר פרופילי ביטוי גנים של סוגי תאים במוח הזבוב. כדי להתחיל, נגב שקופית לא טעונה עם מגיב טיהור RNA. הסר את הסרט האטום המגן על הדבק מאטם הסיליקון.
לאחר מכן הדביקו את האטם המכיל עד ארבעה תאים למגלשה. השתמש בפיפטה P20 כדי לצפות כל משטח תא במיקרוליטר אחד של פוליליזין. לאחר מכן, העבירו עד ארבעה מוחות של דרוזופילה לכל שפופרת לתוך צינור PCR של 0.2 מיליליטר.
החזר לחות למוח ב-150 מיקרוליטר של PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 ואחריו PBS. הוסף 40 מיקרוליטר PBS לכל תא. בעזרת זוג פינצטה עדינה, מקם בעדינות את המוחות בשורה במרכז החדר, והשאיר מרווח ביניהם.
הסר PBS מהתא והוסף מיד 50 מיקרוליטר של מאגר MOPS של 20 מילי-מולרי. בזמן שהמוחות מאזנים במאגר MOPS, פיפטה נפחים שווים של Melphalan-X מופשר לתוך צינור עם מאגר MOPS בנפח שווה. לאחר מכן הוסף פתרון מלאי Ac-X ביחס של אחד ל-100.
מערבל את התמיסה וסובב אותה בקצרה כדי לאסוף אותה. הסר את כל חוצץ ה-MOPS מהתאים והוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת Melphalan-X Ac-X. הנח החלקת כיסוי על גבי כל תא מבלי להשתמש בדבק האטם לאיטום.
לאחר מכן הניחו את החדר בקופסה לחה. למחרת, הסר בזהירות את פתק הכיסוי ושאף את תמיסת Melphalan-X Ac-X. שטפו את המוחות המותקנים פעמיים ב -100 מיקרוליטר של 0.1% PBT, ואחריהם 100 מיקרוליטר PBS.
הניחו תמיסות מופשרות של TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED ואמוניום פרסולפט על קרח. מערבולת את פתרון TREx-1000 כדי להבטיח שאין משקעים. מערבבים את התמיסות להכנת תמיסת ג'ל ומערבולת לפני הציפוי.
בעזרת קצה פיפטה, הוציאו את ה-PBS מהתא ופתלו את כל הנוזלים שנותרו בעזרת מגבון נטול מוך. הוסף מיד 40 מיקרוליטר תמיסת ג'ל על המוח בכל חדר. דגרו את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
כעת הסר את תמיסת הג'ל מהתא. לאחר מכן קלף את סרט המגן השקוף מדבק משטח האטם. הוסף 45 מיקרוליטר אחרונים של תמיסת ג'ל טרייה.
הנח בעדינות פתק כיסוי מעל החדר ולחץ על החלקת הכיסוי כדי לאטום את החדר לפני הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות. דגרו את החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות כדי לפלמר את הג'ל. לאחר קירור הג'לים על ספסל, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר בזהירות את החלקת הכיסוי ואת אטם הסיליקון.
חותכים את הג'ל לצורה מלבנית וחותכים את הפינה הימנית העליונה כדי לציין את כיוון הדגימה. לאחר מכן, השתמש במברשת צבע עדינה שהורטבה בכמות קטנה של מאגר Pro K כדי להרים בזהירות את הג'לים מהשקופית. העבירו כל ג'ל בנפרד לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר.
מערבבים 500 מיקרוליטר של מאגר Pro K וחמישה מיקרוליטרים של אנזים Proteinase K, ומוסיפים את התערובת לכל ג'ל. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הסר את המאגר בעזרת פיפטה גמישה עדינה ולאחר מכן שטוף את הג'לים שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות כל אחד.
דגרו את הג'לים למשך 30 דקות במיליליטר אחד של מאגר DNASE1 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 מיקרוליטר של אנזים DNASE1 עם 450 מיקרוליטר של מאגר DNASE1. מערבבים בעדינות ללא מערבולת.
דגרו כל ג'ל ב -500 מיקרוליטר של תמיסת DNASE1 למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הג'לים ארבע פעמים למשך 15 דקות עם מיליליטר PBS בטמפרטורת החדר. כעת, דגרו את הג'לים ב-500 מיקרוליטר של מאגר הכלאה מופשר ללא בדיקות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
מדללים את הבדיקות במאגר הכלאה ביחס של אחד ל -100, מכינים 300 מיקרוליטר לג'ל. דגרו את הג'לים עם מאגר הכלאה המכיל בדיקות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הג'לים תחילה במאגר שטיפת בדיקה, ואז ב- PBS.
לתגובת שרשרת ההכלאה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הגברה לג'ל ודגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מחממים את סיכות השיער הפלואורסצנטיות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות במכונת PCR ומצננים את התמיסה ל-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עבור כל בדיקה, יש לדלל זוגות סיכות ראש תואמים ביחס של אחד ל-50 במאגר הגברה, ולהכין 300 מיקרוליטר לג'ל.
לאחר מערבולת התערובת, מוסיפים את התערובת לג'לים ודוגרים. כדי להרכיב את הג'ל להדמיית יריעות קלות, מצפים את משטח חיבור הג'ל של מחזיק ג'ל פעמיים במיקרוליטר אחד של פוליליזין, ומניחים לו להתייבש ב-37 מעלות צלזיוס בין שכבות. לאחר מכן, הניחו את הג'ל על החלקת כיסוי כך שהחתך יהיה בצד שמאל.
בעזרת מכחול מעבירים את הג'ל על המשטח המטופל בתנועה אחת. גנים הקשורים למוליכים עצביים וגנים נוירופפטידים הראו דפוסי ביטוי מובהקים במוח הדרוזופילה הבוגר. VGluT ו-Gad1 זוהו באותו סבב הכלאה, והראו דפוסי ביטוי לא חופפים.
AstA הראה ביטוי חזק באונה האופטית וביטוי חלש יותר בקומפלקס המרכזי. Crz התבטא מאוד ב-pars lateralis, בעוד שרמות ביטוי נמוכות יותר נצפו בתאי עצב של האונה האופטית. Tk זוהה בתאי עצב H דלתא D שזוהו עם ביטוי Mer-GFP באמצעות קו GAL4 מפוצל ספציפי על ידי יריעת אור או מיקרוסקופיה קונפוקלית.
FMRFamide נעדר בתאי עצב PFG המסומנים על ידי Mer-GFP, אך זוהה בתאי עצב שמסביב. הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים FB4K אישרה את ההתפלגות המרחבית של תעתיקי VGluT ו-ChAT/VAChT. נוירופפטידים, כגון AstA ו-Crz, מתבטאים כל כך חזק בתאים מסוימים עד שלא ניתן עוד להפריד כתמים פלואורסצנטיים בודדים המייצגים תעתיקים בודדים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג את הטכניקה החדשנית של מיזוג תווך חישוב פלואורסצנטי איטרטיבי במצב היברידי (EASI-FISH), שמשלבת מיקרוסקופיה מורחבת עם פלואורסצנציה במצב היברידי על מנת לצפות בביטוי גנים ברקמות עבות. השיטה מותאמת למערכת העצבים המרכזית של Drosophila, ומאפשרת לחוקרים לחזות את דפוסי הביטוי של גנים רבים ברחבי סוגי תאים שונים.
רכיבים עיקריים של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביטוי גנים
- ביולוגיה של תאים
רקע
- מיקרוסקופיה מורחבת מאפשרת בהירות ורזולוציה אופטית משופרת בהדמיית רקמות עבות.
- פלואורסצנציה במצב היברידי היא שיטה חזקה לזיהוי ביטוי גנים.
- השילוב של טכניקות אלו משפר את היכולת לנתח ארכיטקטורת רקמות מורכבת באורגניזמים מודליים.
- Drosophila משמשת כמודל חשוב להבנת התפתחות עצבית ותפקוד גנים.
מטרת המחקר
- לפרט פרוטוקול חזק המאפשר מספר סבבי חישוב RNA במצב היברידי.
- לאפשר חזות מקיפה של ביטוי גנים במוח ה-Drosophila.
- לספק מסגרת שניתן לאמץ בקלות על ידי מעבדות שונות המצוידות בכלי מיקרוסקופיה בסיסיים.
שיטות ששימשו
- המחקר משתמש בטכניקת הטמעה בהידרוגל על מנת לשמר את שלמות הרקמה במוח ה-Drosophila.
- מודל ביולוגי מרכזי כולל את מערכת העצבים המרכזית השלמה של ה-Drosophila, המתמקדת בביטויי גנים עצביים שונים.
- אין אזכור לזרימות עבודה מולטי-אומיקות במאמר.
- כלולים פרוטוקולים מפורטים לעיבוד רקמות, ההדבקה, וההדמיה.
- התוצאות מאומתות באמצעות ניתוחים של ביטוי מרחבי השוואתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיית גיליון אור.
תוצאות עיקריות
- דפוסי ביטוי מובחנים לגנים הקשורים לנוירוטרנסמיטורים ונוירופפטידים נצפו במוח ה-Drosophila.
- דוגמאות לממצאים כוללות ביטוי לא חופף של VGluT ו-Gad1, מה שמרמז על תפקידים משונים בנוירוטרנסמיסיה.
- נוירופפטידים כמו AstA ו-Crz הפגינו רמות ביטוי גבוהות באזורים עצביים ספציפיים, בהתאם למשמעויות פונקציונליות.
- שיטה זו מאפשרת מיפוי מדויק של ביטוי גנים על פני שכבות תאיות ותורמת להבנת היחסים בין מבנה ותפקוד עצביים.
מסקנות
- EASI-FISH מייצגת התקדמות משמעותית בחזות ביטוי גנים ברקמות מורכבות.
- המחקר מדגיש את השימוש המשלימים בטכניקות הדמיה שונות על מנת לספק תובנות על תפקוד גנים עצביים.
- המשמעויות משתרעות על שיפור ההבנה של מנגנונים עצביים, עם אפליקציות פוטנציאליות בביולוגיה התפתחותית ובנוירוגנטיקה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Multiplexed gene expression mapping in intact neural tissue is a critical capability for early discovery and target validation in neurobiology-focused drug development. The EASI-FISH protocol enables high-throughput, high-resolution detection of dozens of transcripts in the Drosophila brain, supporting robust comparative analyses and reducing reagent costs. This approach enhances predictive confidence in cell-type specific gene expression, informing mechanistic de-risking and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of gene expression patterns across neuronal and glial subtypes.
- Supports functional target validation by visualizing spatial transcript distribution at single-molecule resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing multiplexed detection in disease-relevant neural circuits.
- Improves predictive confidence for target selection and prioritization in neurogenetics pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed tissue systems for downstream screening and phenotypic assays.
- Standardizes assay conditions by embedding multiple brains per gel, enabling direct comparison of experimental variables.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of gene expression for reliable compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse through robust gel formulation and iterative hybridization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression mapping with translational biomarker discovery in neural tissue models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling high-throughput, cell-type specific analyses.
- Reduces biological risk in advancing neuroactive compounds by clarifying target engagement in complex tissue contexts.
Pipeline & Workflow Integration
EASI-FISH integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and translational research in neurobiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping multiplexed gene expression in situ.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible tissue systems for quantitative evaluation of gene modulation.
- Analytics: Enables single-transcript resolution and spatial quantification for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by aligning gene expression data with disease-relevant neural circuits.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed gene expression analysis across diverse neurobiological models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in gene expression workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal or light sheet microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to robust imaging infrastructure and commercially available reagents.
- Demands cross-team standardization for gel preparation and hybridization protocols.
- Adaptable to other model systems with optimization of gel and probe conditions.
- Throughput and multiplexing are limited by imaging capacity and probe design constraints.
