Name: בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: למדו שיטת טיפות לבדיקת ציטוטוקסיות של תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד. השיטה מאפשרת זיהוי אוכלוסיות משנה שונות ושיפור הבנת התפקודיות של תאי CAR T בטיפול בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Pasqui, D. M., Latorraca, C. D. O. C., Pacheco, R. L., Riera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy+for+patients+with+hematological+malignancies.+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy for patients with hematological malignancies. A systematic review.</a> Eur J Haematol. 109 (6), 601-618 (2022).</li>
<li>Krejcik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+fight+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to fight multiple myeloma.</a> Cancers. 13 (18), 4546(2021).</li>
<li>Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+an+old+dog+new+tricks%3A+next-generation+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Teaching an old dog new tricks: next-generation CAR T cells.</a> British J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).</li>
<li>Bogetofte Barnkob, M., Vitting-Seerup, K., Rønn Olsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+isoforms+are+an+overlooked+challenge+and+opportunity+in+chimeric+antigen+receptor+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunother+Adv%22%5BJournal%5D)">Target isoforms are an overlooked challenge and opportunity in chimeric antigen receptor cell therapy.</a> Immunother Adv. 2 (1), ltac009(2022).</li>
<li>Daei Sorkhabi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+landscape+of+CAR+T-cell+therapy+for+solid+tumors%3A+Mechanisms%2C+research+progress%2C+challenges%2C+and+counterstrategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The current landscape of CAR T-cell therapy for solid tumors: Mechanisms, research progress, challenges, and counterstrategies.</a> Front Immunol. 14, 1113882(2023).</li>
<li>Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products. , Center for Biologics Evaluation and Research. 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/considerations-development-chimeric-antigen-receptor-car-t-cell-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/considerations-development-chimeric-antigen-receptor-car-t-cell-products</a> (2024).</li>
<li>Roddie, C., O'Reilly, M., Dias Alves Pinto, J., Vispute, K., Lowdell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+issues+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges.</a> Cytotherapy. 21 (3), 327-340 (2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+in+vitro+potency+assays+by+a+resting+step+for+clinical-grade+chimeric+antigen+receptor+engineered+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improvement of in vitro potency assays by a resting step for clinical-grade chimeric antigen receptor engineered T cells.</a> Cytotherapy. 21 (5), 566-578 (2019).</li>
<li>Burrows, S. R., Fernan, A., Argaet, V., Suhrbier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+apoptosis+induced+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+%28CTL%29+clones%3A+implications+for+CTL+lytic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bystander apoptosis induced by CD8+ cytotoxic T cell (CTL) clones: implications for CTL lytic mechanisms.</a> Int Immunol. 5 (9), 1049-1058 (1993).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Chen, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bulk+and+single-cell+profiling+of+premanufacture+T-cell+populations+reveals+factors+mediating+long-term+persistence+of+CAR+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Dis%22%5BJournal%5D)">Integrative bulk and single-cell profiling of premanufacture T-cell populations reveals factors mediating long-term persistence of CAR T-cell therapy.</a> Cancer Dis. 11 (9), 2186-2199 (2021).</li>
<li>Frazer, G. L., Gawden-Bone, C. M., Dieckmann, N. M. G., Asano, Y., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+strength+controls+the+rate+of+polarization+within+CTLs+during+killing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal strength controls the rate of polarization within CTLs during killing.</a> J Cell Biol. 220 (10), e202104093(2021).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Meth. 285 (1), 25-40 (2004).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li>
<li>Piccinini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+CAR-T+cell+killing%3A+validation+of+the+potency+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother+CII%22%5BJournal%5D)">In vitro CAR-T cell killing: validation of the potency assay.</a> Cancer Immunol Immunother CII. 73 (9), 168(2024).</li>
<li>Martinez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+flow+cytometric+method+for+the+simultaneous+measurement+of+CAR-T+cell+characterization+and+cytotoxicity+against+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Disc+Adv+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">High-throughput flow cytometric method for the simultaneous measurement of CAR-T cell characterization and cytotoxicity against solid tumor cell lines.</a> SLAS Disc Adv Life Sci. 23 (7), 603-612 (2018).</li>
<li>Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M. Y., Willemze, R., Falkenburg, J. H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+imaging+of+CAR-T+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular imaging of CAR-T cell-based immunotherapy.</a> Adv Drug Delivery Rev. 203, 115135(2023).</li>
<li>Liadi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+potency+of+CAR%2B+T+cells%3A+Fast+and+furious+or+slow+and+steady%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Defining potency of CAR+ T cells: Fast and furious or slow and steady.</a> Oncoimmunology. 8 (10), e1051298(2019).</li>
<li>Xhangolli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+CAR-T+cell+activation+reveals+a+mixed+TH1%2FTH2+response+independent+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Proteom+Bioinfo%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of CAR-T cell activation reveals a mixed TH1/TH2 response independent of differentiation.</a> Genom Proteom Bioinfo. 17 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+single-cell+cytokine+secretion+and+cell-cell+interactions+with+a+hierarchical+loading+microwell+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of single-cell cytokine secretion and cell-cell interactions with a hierarchical loading microwell chip.</a> Cell Rep. 31 (4), 107574(2020).</li>
<li>LaBelle, C. A., Zhang, R. J., Hunsucker, S. A., Armistead, P. M., Allbritton, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microraft+arrays+for+serial-killer+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+and+single+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+J+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Microraft arrays for serial-killer CD19 chimeric antigen receptor T cells and single cell isolation.</a> Cytometry J Int Soc Anal Cytol. 103 (3), 208-220 (2023).</li>
<li>Hellmann, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneously+deacetylated+chitosans+possess+an+unexpected+regular+pattern+favoring+acetylation+at+every+third+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Heterogeneously deacetylated chitosans possess an unexpected regular pattern favoring acetylation at every third position.</a> Nat Comm. 15 (1), 6695(2024).</li>
<li>Wong, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chimeric+antigen+receptor+T+cytotoxicity+by+droplet+microfluidics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antibody+Therapeut%22%5BJournal%5D)">Assessment of chimeric antigen receptor T cytotoxicity by droplet microfluidics in vitro.</a> Antibody Therapeut. 5 (2), 85-99 (2022).</li>
<li>Antona, S., Platzman, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay%3A+Implementation+of+time-efficient+screening+of+antitumor+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay: Implementation of time-efficient screening of antitumor activity of natural killer cells.</a> ACS omega. 5 (38), 24674-24683 (2020).</li>
<li>Subedi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+real-time+microfluidic+platform+to+probe+single+NK+cell+heterogeneity+and+cytotoxicity+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An automated real-time microfluidic platform to probe single NK cell heterogeneity and cytotoxicity on-chip.</a> Sci Rep. 11 (1), 17084(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas12a-based+quantitative+detection+of+nucleic+acids+using+double+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelect%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas12a-based quantitative detection of nucleic acids using double emulsion droplets.</a> Biosens Bioelect. 257, 116339(2024).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+preclinical+evaluation+of+an+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor.</a> J Immunother. 32 (7), 689-702 (2009).</li>
<li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nat Comm. 10 (1), 818(2019).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+encapsulation+improves+accuracy+of+immune+cell+cytokine+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet encapsulation improves accuracy of immune cell cytokine capture assays.</a> Lab on a Chip. 20 (8), 1513-1520 (2020).</li>
<li>Brower, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+flow+cytometry+with+high-throughput+single+droplet+isolation+and+nucleic+acid+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).</li>
<li>Kirouac, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+clinical+variance+in+CAR-T+cell+pharmacology+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of clinical variance in CAR-T cell pharmacology and response.</a> Nat Biotechnol. 41 (11), 1606-1617 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חוסם חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (BSA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>ערכת התפשטות תאים אדומים רחוקים של CellTrace (צבע פלואורסצנטי אדום רחוק)</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td></td></tr><tr><td>ערכת התפשטות תאים סגולים של CellTrace (צבע פלואורסצנטי סגול)</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>DE תמיסה מייצבת ( פתרון מייצב)</td><td>Samplix</td><td>REDIVSTABSOL1500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (dPBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-activator (חרוזי הפעלה CD3/CD28)</td><td>Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>רכז Lenti-X (ריאגנט מבוסס PEG)</td><td>Takara Bio</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>MACSבחר LNGFR Microbeads (חרוזים מגנטיים נגד NGFR)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-330</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep מדיום שיפוע צפיפות (מדיום שיפוע)</td><td>תא גזע</td><td>7820</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)</td><td>מזל גדי מדעי</td><td>PS-B</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>BMS500PI</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-2 (IL-2)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 עם גלוטמין יציב ( RPMI-1640)</td> <td>מזל גדי מדעי</td><td>RPMI-STA</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 ללא L-גלוטמין ופנול אדום</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE שמן I (שמן)</td><td>Samplix</td><td>REOILDEC1900</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop Granzyme B מצע (מצע GzmB)</td><td>Samplix</td><td>REGRB100</td><td></td></tr><tr><td>צבע חי Zombie-NIR (צבע חיות)</td><td>BioLegend</td><td>423106</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כלי פלסטיק וכו '</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 חדרים זכוכית שקופית</td><td>Chemometec</td><td>942-0003</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים, 12 בארות</td><td>TH Geyer</td><td>7696791</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind שפופרת, 2 מ"ל (צינור DNA)</td><td></td> צינור <td>Eppendorf</td> 30108078 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf, 1.5 מ"ל (צינור 1.5 מ"ל</td>) צינור <td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 15 מ"ל ( צינור 15 מ"ל</td>) <td>צינור TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>פלקון, 5 מ"ל (צינור 5 מ"ל)</td><td>בז (VWR)</td><td>734-0443</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרחיף תאים ירוקים לדגירת תאים (בקבוק T75)</td><td>Sarstedt</td><td>148.19.22</td><td></td></tr><tr><td>לוחות השעיה של תאים ירוקים לדגירת תאים (צלחת 96 באר)</td><td>Sarstedt</td><td>148.32.20</td><td></td></tr><tr><td>עמודי הפרדה LS (עמודת הפרדה)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>אטמי Xdrop DE (אטמים)</td><td>Samplix</td><td>#GADEA100</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE50 מחסנית (מחסנית אנקפסולציה)</td><td>Samplix</td><td>#CADE50A100</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CCR7 PE-Dazzle 594</td><td>BioLegend</td><td>353236</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD19 CAR FMC63 אידיוטיפ נוגדן, PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-342</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 APC</td><td>Biolegend</td><td>300439</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 BV480</td><td>BD Biosciences</td><td>566105</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 BUV661</td><td>BD Biosciences</td><td>612962</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 StarBright Violet 760</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1267SBV760T</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45RA BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>740298</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>344712</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 StarBright Violet</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1226SBV760</td><td></td></tr><tr><td>anti-NGFR FITC</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td></td></tr><tr><td>anti-NGFR PE</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1 קו תאי לימפומה של תאי מעטפת (JeKo-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td></td></tr><tr><td>תאים חד-גרעיניים ראשוניים בדם היקפי (PBMCs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוזנת 3 מונה תאים אוטומטי</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 מגנט</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Quanteon Flow Cytometer (ציטומטר זרימה)</td><td>Agilent</td><td>2010011AA</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop (מכשיר מיקרופלואידיקה)</td><td>Samplix</td><td>IN00110-EU</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי t קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

Droplet-based Cytotoxicity Assay to Assess Chimeric Antigen Receptor T cells at the Single-cell Level

לאחר הטרנסדוקציה, תאי ה-T נותחו לביטוי CAR על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות נוגדנים נגד CD3 ואנטי-NGFR. אוכלוסיית תאי ה-CAR T הועשרה לאחר מכן באמצעות חרוזים מגנטיים נגד NGFR, וכתוצאה מכך טוהר של יותר מ-98% עבור שני התורמים (איור 1A-B). יחס CD4/CD8 ופנוטיפ הזיכרון של תאי CAR ממוינים ששימשו כומתו גם הם, תוך שימוש באסטרטגיית שער סטנדרטית המשתמשת בנוגדנים CCR7 ו-CD45RA. הנתונים האלה מראים שיחס CD4/CD8 של תאי CAR T בשימוש היה 0.73, והתאים היו בעיקר של פנוטיפ זיכרון דמוי נאיבי (איור 1C-E).
תאי CAR T ותאי JeKo-1 נצבעו בצבעים סגולים ואדומים רחוקים, בהתאמה, ונכללו בטיפות DE50 יחד עם ריאגנטים לבדיקה מצע GzmB ו-PI (איור 2). לחלופין, ניתן לתייג תאי T CAR גם באמצעות נוגדנים כגון anti-CD4 או anti-CD8 (איור 3), מה שמאפשר אפיון מפורט יותר של תאי T. כל תרחיף תאי T (CAR T או NTD) עורבב עם תרחיף תאי JeKo-1 מיד לפני האנקפסולציה באפקטור: יחס תאי מטרה של 1:3 (0.5 x 106 תאי T ו-1.5 x 106 JeKo-1). לאחר האנקפסולציה, כל ייצור טיפות (תאי CAR T + JeKo-1 ו-NTD + JeKo-1) חולק לשלושה צינורות דגירה למשך 2 שעות, 4 שעות ו-6 שעות, בהתאמה. התאים הודגרו בתוך הטיפות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 ולאחר מכן נותחו על ידי מיקרוסקופיה וזרימה ציטומטרית בנקודות הזמן שצוינו.
ביצענו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של טיפות אמולסיה כפולה אחרי 4 שעות של דגירה (איור 4). עוצמת האות הקרינה הירוק (FITC) ממחישה את רמת פעילות ה-GzmB המופרש של תאי CAR T או NTDs בתוך טיפות DE50. איור 4B מציג תמונות ניגודיות פאזה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של טיפה אחת חיובית ל-GzmB המכילה תא CAR T ותא מטרה JeKo-1 במגע קרוב.
לאחר מכן, טיפות DE50 נותחו על ידי זרימה ציטומטרית כדי לכמת את אחוז תאי ה-CAR T עם הפרשת GzmB מוקדמת ופעילות הרג תאים ציטוטוקסית (איור 5). צביעה לפני הדגירה של תאי מטרה JeKo-1 עם צבע אדום רחוק ותאי T אפקטור עם צבע סגול לפני האנקפסולציה אפשרה זיהוי של שלוש אוכלוסיות טיפות נפרדות המכילות תאים כאשר התאים מופצים בטיפות על סמך התפלגות פואסון. אוכלוסיות הטיפות שזוהו הן טיפות עם תאי T בלבד, תאי JeKo-1 בלבד, ותאי T ותאי JeKo-1 יחד (איור 5A). טיפות שעוטפות תאי T עם תאי JeKo-1 היו מגודרות ונותחו לאיתור אותות המצביעים על פעילות GzmB (איור 5B) ומוות של תאים, כפי שמצוין על ידי PI (איור 5C).
האנקפסולציה של תאים בטיפות עוקבת אחר התפלגות פואסון, ומתקבלות ארבע אוכלוסיות טיפות שונות (איור 6A). איור 6B מראה את רמת הטיפות החיוביות ל-GzmB בכל אוכלוסיות הטיפות לאחר 6 שעות דגירה של טיפות שמהן ניתן לקבוע את אחוז תאי ה-T המפרישים GzmB באופן ספונטני. נתונים אלה מצביעים על הספציפיות הגבוהה של השיטה, שכן רק תאי T של CAR מפרישים GzmB.
לבסוף, כימתנו את רמות GzmB ו-PI על פני נקודות זמן, לאחר 2 שעות, 4 שעות ו-6 שעות של דגירה משותפת. לשם השוואה, הטיפות המכילות רק תאי T ורק תאי JeKo-1 נותחו כדי לבחון את מוות תאי הרקע בכל אוכלוסייה (איור 6C). מוות תאי הרקע שימש לקביעת אחוז תאי T חיים המפרישים GzmB והורגים תאי מטרה באוכלוסיית תאי האפקטור (איור 7), כמתואר בשלב 3.3. תאי CAR T משני תורמים הראו עלייה תלוית זמן הן בהפרשת GzmB המושרה על ידי תאי מטרה והן בפעילות הריגת התאים. כמעט 36% מתאי ה-CAR T החיים מתורם 1 ו-31% מתורם 2 הפרישו GzmB לאחר 6 שעות של אנקפסולציה משותפת עם תא המטרה, עלייה משמעותית בהשוואה לתאי T בקרה של NTD (איור 7A). בהתאמה, כ-21% מתאי ה-CAR T החיים של תורם 1 ו-22% מתאי ה-CAR החיים של תורם 2 הרגו תאי מטרה, כפי שמצוין על ידי אות PI חיובי (איור 7B). אחוז תאי ה-CAR T שהפרישו GzmB עלה על אחוז תאי המטרה שנהרגו בכל נקודת זמן, בהתאם לרצף האירועים הצפוי בציטוטוקסיות בתיווך GzmB. יחד, נתונים אלה מראים כי השיטה המוצגת כאן מאפשרת לאפיין את ההטרוגניות בציטוטוקסיות של תאי T בודדים בתוך אוכלוסיית תאים וכן השוואות בין אוכלוסיות שונות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig01.jpg"> 
איור 1: תרשימי ציטומטריית זרימה מייצגת לאחר מיון NGFR. (A) אחרי כ-10 ימים של התרחבות, תאי CAR T מוינו באמצעות מיקרו-חרוזים ספציפיים ל-NGFR ומיון מגנטי, וכתוצאה מכך אוכלוסייה של תאי CAR T שהייתה &gt;98% תאי CAR T. (B) כימות של תאי CAR T משני תורמים ששימשו במחקר הזה לפני ואחרי המיון. (C) אסטרטגיית שער המשמשת לבחינת יחס CD4/CD8 ופנוטיפ זיכרון של תאי T. (D) כימות CD4 ו-CD8 של תאי T בשימוש. (E) כימות פנוטיפ הזיכרון של תאי T בשימוש. קיצור: CM = זיכרון מרכזי, EM = זיכרון אפקטור, NTD = לא מתמר, TEMRA = תאי אפקטור מובחנים סופית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig02.jpg"> 
איור 2: זרימת עבודה עבור מבחן הפרשת GzmB וציטוטוקסיות משולבת עם רזולוציית תא בודד בטיפות. לפני האנקפסולציה בטיפות DE, תאי המטרה והאפקטור נצבעים בנפרד באמצעות כתמי תאים סגולים ואדומים רחוקים. באמצעות מכשיר המיקרופלואידיקה ומחסנית האנקפסולציה, תאי אפקטור עטופים יחד עם תאי מטרה בטיפות יחד עם מדיום התא, PI ומצע פפטיד GzmB המסומן על ידי FAM. הבדיקה והדגירה מתרחשות בתוך הטיפות. פעילות GzmB מופרשת מסומנת על ידי פליטת פלואורסצנציה ירוקה המתרחשת לאחר ש-GzmB מבקע את המצע. מוות תאים מסומן על ידי PI. לאחר הדגירה, טיפות DE50 מנותחות על ידי מיקרוסקופיה ו/או ציטומטריית זרימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig03.jpg"> 
איור 3: ניתוח של PBMCs עטופים טיפות המסומנים מראש בנוגדנים anti-CD3, anti-CD4 ו-anti-CD8. (A) תמונות מיקרוסקופיה של טיפות עם PBMCs עטופים שסומנו מראש עם נוגדנים נגד CD3 (APC) ואנטי-CD4 (NIR). Scalebar = 100 מיקרומטר. (B) כ-(A), אך עם תיוג CD3 (FITC) ו-anti-CD8 (NIR) במקום. Scalebar = 100 מיקרומטר. (C) ניתוח ציטומטריית זרימה של אותן טיפות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig04.jpg"> 
איור 4: תמונות מיקרוסקופ של טיפות עם תאי אפקטור ותאי מטרה. התמונות צולמו לאחר 4 שעות דגירה בחממת תאים לחה סטנדרטית של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 . (A) טיפות מדגימה עם תאי NTD ו-JeKo-1 עטופים (משמאל) או תאי CAR T ותאי JeKo-1 (מימין) שצולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית באמצעות ערוץ FITC כדי לזהות טיפות חיוביות (ירוקות) של GzmB. Scalebar = 500 מיקרומטר. (B) טיפה בודדת המצולמת על ידי ניגודיות פאזה, FITC (GzmB), APC (תא JeKo-1) ו-DAPI (תא CAR T). Scalebar = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig05.jpg"> 
איור 5: אסטרטגיית שער לניתוח טיפות על ידי זרימה ציטומטרית לאחר הדגירה. (A) שער נעשה על ידי פיזור קדימה וצדדי כדי לזהות טיפות, ואחריו בחירת השער המכיל את הטיפות. האירועים מחוץ לשער מייצגים טיפות שמן המיוצרות כתוצר לוואי של ייצור טיפות אמולסיה כפולה. ניתוח פלואורסצנטי עוקב של טיפות בתעלות המתאימות לכתמי התאים המיושמים מזהה ארבע אוכלוסיות טיפות: טיפות המכילות גם תאי T וגם תאי JeKo-1 (ריבוע אדום); טיפות עם תאי JeKo-1 בלבד; טיפות עם תאי T בלבד; וטיפות ריקות. (B) היסטוגרמות מייצגות עבור אות GzmB בטיפות חיוביות כפולות על פני נקודות זמן ובין תאי NTD ו-CAR T. (C) היסטוגרמות מייצגות עבור אות PI בטיפות חיוביות כפולות על פני נקודות זמן ובין תאי T NTD ו-CAR. כל מדידות הטיפות מבוצעות כמדידות גובה עוצמה (H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig06.jpg"> 
איור 6: אוכלוסיות בקרה פנימית ואוכלוסיות ייחוס. (A) כל אחד מארבעת הרבעים מאיור 5A נבחר, ו-GzmB ו-PI נמדדו בכל אחד מהם. סוג זה של כימות מאפשר למדוד ולהחסיר אותות רקע לפני ביצוע ניתוח סופי של יעילות תאי T. (B) גרף שמראה את תדירות הטיפות החיוביות של GzmB אחרי 6 שעות דגירה עבור כל אחת מארבע אוכלוסיות הטיפות, שמודגם על ידי נתונים מדגימת תורם 1 CAR T. (C) מוות תאי רקע נקבע באוכלוסיות טיפות ביקורת של JeKo-1 בלבד ותאי T בלבד בכל נקודת זמן שנמדדה, עם נתונים מתורם 1. מוות תאי הרקע משמש לחישוב התדירות של תאי אפקטור חיים המפרישים GzmB והורגים תאים המוצגים באיור 7 ומוסברים בשלב 3.3. קיצורים: Pre = אנקפסולציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig07.jpg"> 
איור 7: כימות של תאי T המסוגלים להפריש GzmB ולהרוג תאי JeKo-1 בטיפות חיוביות כפולות. טיפות חיוביות כפולות מגודרות משני תורמים נבדקו לאחר דגירה משותפת של 2 שעות, 4 שעות ו-6 שעות בטיפות. (A) תדירות תאי T המפרישים GzmB בתאי מטרה והשוואה בין תאי NTD T לתאי T CAR. (B) תדירות תאי T שנתקלים בתאי מטרה שהורגים את תא המטרה המשותף. קיצורים: GzmB = גרנזים B, NTD = לא מתמר, PI = פרופידיום יודיד. * = ערך P &lt; 0.05, ** = ערך P &lt; 0.005, **** = ערך P &lt; 0.0001 על ידי ANOVA דו-כיווני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

The assessment of the cytotoxic potential of T cell-based therapies, such as chimeric antigen receptor (CAR) T cell treatments, is instrumental in ...

droplet-based-cytotoxicity-assay-to-assess-chimeric-antigen-receptor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים שיטה לניטור פעילות תאי CAR T נגד תאים סרטניים באמצעות מדידות עכבה חשמלית בזמן אמת. מעקב אחר שינויים בעכבה מעריך את היעילות של תאי CAR T בגרימת ציטוליזה של תאים סרטניים, ומספק תובנות לגבי יכולותיהם ציטוטוקסיות.

בדיקת ציטוליזה חוץ גופית בזמן אמת להערכת העוצמה של תאי CAR T

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

אנו מתארים כמותית בזמן אמת במערכת החשיבה של הפריה חוץ גופית כדי להעריך את העוצמה של מערכת הקולטן אנטיגן כימאריק תאי T מיקוד תאי הגידול נוזלי ומוצק. פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי להעריך תאים אחרים החיסון החיסונית, כמו גם טיפולים משולבים.

שיטת העוצמה בזמן אמת עבור שצ אנטיגן קולטן התאים T המיקוד תאים מוצק המטולוגי סרטן

כאן נתאר שיטת הפריה תרבות משותפת כדי באופן רקורסיבי אתגר, ממוקדות גידול תאי T, המאפשר ניתוח פנוטיפי ופונקציונליים של פעילות antitumor תא T...

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מודל xenograft הנגזר מחולה לוקמיה לימפובלסטית חריפה משמש כאסטרטגיה להערכה וניטור רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי ממוקד CD19 תאי T.

הערכה של רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי T באמצעות מודל עכבר קסנוגרפט שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית חריפה

פרוטוקול להערכת הרג כמותי של תאי גידול על ידי תאי Jurkat המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לאנטיגן גידול יחיד. פרוטוקול זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון לאופטימיזציה מהירה של מבני צירי CAR לפני אישור בתאי T היקפיים שמקורם בדם.

הערכת ציטוטוקסיות מהירה במבחנה של קולטן אנטיגן כימרי Jurkat באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים (CAR) באמצעות mRNA לא משולב לאימונותרפיה לסרטן ומספק שיטות אמינות להערכת תאי CAR-T ותפקודם ציטוטוקסי.

גישה לא ויראלית ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים באמצעות mRNA לאימונותרפיה לסרטן

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מאוזן במבחנה למדידה עקבית של ציטוטוקסיות טבעית, מתווכת קולטני אנטיגן כימריים ותלויה בנוגדנים של תאי רוצח טבעיים אנושיים, באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה.

כימות ציטוטוקסיות של תאי NK המועצמת על ידי קולטני אנטיגן כימריים ונוגדנים טיפוליים באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום...

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

פתוגנזה של HIV-1 מוגדרת הן על ידי מאפיינים נגיפיים והן על ידי גורמים גנטיים של המארח. כאן אנו מתארים שיטה חזקה המאפשרת מדידות הניתנות לשחזור כדי להעריך את ההשפעה של וריאציה של רצף גן ה-gag על יכולת השכפול במבחנה של הנגיף.

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

למדו שיטת טיפות לבדיקת ציטוטוקסיות של תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד. השיטה מאפשרת זיהוי אוכלוסיות משנה שונות ושיפור הבנת התפקודיות של תאי CAR T בטיפול בסרטן.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

גלה סרטונים נוספים