ניתוח יציבות פלסמיד עם מיקרופלואידיקה טיפתית בקוד פתוח
27 בדצמבר 2024
זרימת עבודה מיקרופלואידית נגישה בקוד פתוח מוצגת לניתוח מקביל של שימור פלסמיד בחיידקים. על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לכמת נוכחות פלסמיד במיקרו-מושבות חד-תאיות בתוך מיקרו-טיפות ג'ל, שיטה זו מספקת אלטרנטיבה מדויקת, נגישה וניתנת להרחבה לספירת צלחות מסורתית.
אנו מפתחים שיטות IC מיקרופיליות בתפוקה גבוהה לחקר מגוון אוכלוסיות התאים ואינטראקציות תא-תא. בהקשר זה, מיקרו-טיפות ג'ל מאפשרות לנו לבצע שלבי פרוטוקול שימושיים, כמו מניפולציה של DNA צביעת ליזה ומיקרוסקופיה בצורה משותקת מאוד בתאים לכודים. זרימות עבודה מיקרופיליות של טיפות ידועות בתפוקה וברבגוניות אולטרה-גבוהות, אך האימוץ מוגבל לרוב על ידי הצורך במכשור מתקדם ומומחיות מיוחדת.
הפרוטוקול שלנו משפר טכניקות מסורתיות באמצעות ניתוח תא בודד בתפוקה גבוהה עם צביעה פלואורסצנטית וזרימת עבודה נגישה של מיקרוסקופיה בקוד פתוח. הוא עוטף תאים במיקרו-טיפות ג'ל באמצעות מיקרופלואידיקה כדי לנתח מיני-תאים ומיקרו-מושבות בו זמנית. בעוד שתרביות בתפזורת וצלחות חסרות ספציפיות ורזולוציה, שיטה זו מספקת סטטיסטיקה מדויקת ומייצגת של תופעות מגוונות.
הפרוטוקולים שלנו משלבים מיקרופלואידיקה טיפתית, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וחומרה בקוד פתוח בשיטה מבוססת תוויות. גישה זו הופכת את ניתוח התא הבודד לגמיש ובמחיר סביר יותר, ומאפשרת לקהילה המדעית לענות על שאלות מדעיות מורכבות הנוגעות לקהילות מיקרוביאליות. כדי להתחיל, יש לחמם אגרוז בטמפרטורת ג'ל נמוכה במיוחד בריכוז של 2% עד 90 מעלות צלזיוס במרק Luria Bertani, או LB.
מנערים את התערובת במשך 10 דקות בשייקר מבוקר טמפרטורה, ואז מורידים את הטמפרטורה של שייקר התרמו ל-39 מעלות צלזיוס כדי לקרר את תמיסת האגרוז. הנח את צינור התרחיף Escherichia coli בשייקר התרמו למשך ארבע דקות כדי לחמם אותו ל-39 מעלות צלזיוס. מערבבים את תרחיף החיידקים ותמיסת האגרוז ביחס של אחד לאחד כדי להשיג ריכוז אגרוז של 1% עם תרחיף תאים של 3.1 כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר.
הכן את תמיסת הבקרה השלילית לניטור זיהום באמצעות תרחיף LB ואגרוז ביחס של אחד לאחד. השג את פלטפורמת הזרימה המלאה בקוד פתוח, כולל דוחפי לחץ גז וחיישני זרימה. כלול מגלשת זכוכית ומחממי קצה פיפטה בהתקנה כדי לשלוט בטמפרטורה של דגימת תא האגרוז כשהיא נכנסת לשבב.
לאחר מכן, מקם את השבב המיקרופלואידי על שלב המיקרוסקופיה המשופרת ב-strobe, וודא שצומת יצירת הטיפות נראה. הגדר את מחמם קצה הפיפטה ומחמם שקופיות הזכוכית ל-40 מעלות צלזיוס באמצעות ממשק תוכנת הבקרה. בעזרת מזרק עם צינור ותקע PDMS, טען את תערובת המתלים של תאי אגרוז 1% לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.
הכנס את הקצה למחמם הקצה והנח אותו על כניסת השלב המימי בשבב המיקרופלואידי. החלף את אטם ה-PDMS של הקצה עם זה המחובר לצינורות מערכת בקרת הזרימה. לאחר מכן, הכנס את צינור השמן לכניסה השנייה ואת קצה צינור היציאה לצינור פסולת.
לאחר מכן הגדר את הלחץ ל-80 מיליבר עבור שלבי ההסכמה והשמן בממשק המשתמש, והתחל בעירוי של תרחיף התא והשמן. כוונן את שלב השמן ל -320 מיליבר ואת שלב ההסכמה ל -180 מיליבר. אפשר דקה אחת לייצוב יצירת הטיפות.
לאחר שייצור הטיפות מתייצב, העבר את צינור היציאה מצינור הפסולת לצינור האיסוף. המשך לאסוף טיפות על קרח עד שמאגר הדגימה יתרוקן. לאחר האיסוף, הניחו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לתת לג'ל האגרוז להיכנס לטיפות.
דגרו על מיקרו-טיפות הג'ל המכילות חיידקים וטיפות הבקרה השליליות ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות או למשך הלילה לצמיחת המושבה. לאחר הדגירה, השתמש במזרק של שלושה מיליליטר עם מחט בגודל 21 כדי להסיר בזהירות כמה שיותר שמן מבסיס תחליב המיקרו-טיפות ג'ל. העבירו 50 מיקרוליטר של מיקרו-טיפות הג'ל למיקרו-צינור חדש, ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס לניתוח טיפות נוסף, הוסיפו תערובת אחד לאחד של שמן מופלר עם PFO בנפח השווה לאמולסיה שנותרה.
לאחר מכן, הוסף כ-200 מיקרוליטר של מאגר נתרן כלורי 0.9% על גבי האמולסיה. מערבל את התערובת, וסובב אותה לזמן קצר בצנטריפוגה במהירות קבועה. הסר בזהירות את שלב השמן מתחתית הממשק הנוזלי והשליך 100 מיקרוליטר תמיסת נתרן כלורי מלמעלה.
העבירו שני מיקרוליטרים של מיקרו-טיפות ג'ל לשקופית תא הדמיה והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של שמן מופלר כדי לסייע ביצירת שכבה אחת של טיפות להדמיה אופטימלית. במיקרוסקופ, הפעל את תאורת מטריצת ה-LED הלבנה מלמעלה להדמיית שדה בהיר. הרכיב את השקופית המוכנה.
התמקד בדגימה כדי לאתר שכבה אחת של טיפות וללכוד תמונת שדה בהיר. לאחר מכן, כוונן את גלגל המסנן כך שיתיישר עם מסנן אורך הגל הירוק. עבור ל-LED של 470 ננומטר לעירור, ומבלי להזיז את הדגימה, צלם תמונה פלואורסצנטית של המושבות.
העבירו שני מיקרוליטרים של המיקרו-ג'לים המוכתמים בפרופידיום יודיד לשבב תא הדמיה והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תמיסת נתרן כלורי 0.9% ליצירת שכבה אחת של מיקרו-ג'לים. אטום את הכניסה והיציאה של השבב כדי למנוע אידוי במהלך ההדמיה. כוונן את מסנן מרווח אורך הגל האדום להדמיית פרופידיום יודיד, וצלם את תמונות השדה הבהיר והפלואורסצנט.
אנקפסולציה של תאים במיקרו-טיפות ג'ל אושרה על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר, המראה טיפות אחידות עם תאים עטופים מובחנים. מושבות שאיבדו פלואורסצנטיות מקודדות פלסמיד זוהו באמצעות ניתוח יחס פלואורסצנטי. מתוך 2,785 מושבות שנותחו, 100 מושבות איבדו את הקרינה, מה שמעיד על שיעור אובדן פלסמיד של 3.6%
סקירה כללית
מחקר זה מציג זרימת עבודה מיקרופלואידית בקוד פתוח לניתוח שימור פלסמיד בחיידקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השיטה מאפשרת כימות מדויק של נוכחות פלסמידים במיקרו-מושבות של תאים בודדים העטופים במיקרו-טיפות ג'ל, ומספקת חלופה ניתנת להרחבה לספירת מוחות מסורתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- טכניקות מיקרופלואידיקה מאפשרות ניתוח בעוצמה גבוהה של אוכלוסיות תאים.
- שיטות מסורתיות חסרות לעיתים קרובות ספציפיות ורזולוציה.
- מיקרו-טיפות ג'ל מספקות פלטפורמה ורסטילית לניתוח תאים בודדים.
- גישות בקוד פתוח יכולות להנגיש מתודולוגיות מתקדמות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה בעלת תפוקה גבוהה לבדיקת שימור פלסמידים בחיידקים.
- שיפור הנגישות והעלות של טכניקות לניתוח תאים בודדים.
- אספקת חלופה ניתנת להרחבה לשיטות תרבית מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מיקרו-טיפות של ג'ל אגרוז המכילות תאי חיידקים.
- שימוש במיקרופלואידיקה ליצירה ומניפולציה של טיפות.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לדימוי ולכימות של שימור פלסמידים.
- ניתוח פלואורסצנציית מושבות לקביעת שיעורי אובדן פלסמידים.
תוצאות עיקריות
- אישור כליאת תאים במיקרו-טיפות ג'ל באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield microscopy).
- זיהוי שיעור אובדן פלסמיד של 3.6% בקרב המושבות שנותחו.
- הדגמת יעילותו של זרימת העבודה (workflow) בקוד פתוח לניתוח בתפוקה גבוהה.
- מתן נתונים סטטיסטיים מדויקים על שימור פלסמידים באוכלוסיות חיידקים מגוונות.
מסקנות
- השיטה שפותחה משפרת את חקר הקהילות המיקרוביאליות.
- היא מציעה גישה גמישה וזולה לניתוח תאי-בודד (single-cell analysis).
- תהליך עבודה זה יכול להיות מאומץ על ידי חוקרים בעלי רמות מומחיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
יציבות פלסמידים היא פרמטר קריטי בביולוגיה סינתטית ובהנדסה מיקרוביאלית, המשפיע ישירות על מהימנותם של זנים מהונדסים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה. ניתוח כמותי בתפוקה גבוהה של שימור פלסמידים ללא ברירה אנטיביוטית מאפשר תיקוף יעיל של מטרות ומפחית סיכונים בתהליכי גילוי מוקדמים. מיקרופלואידיקה של טיפות בקוד פתוח הופכת את הגישה לאנליטיקה מתקדמת של תא בודד לנגישה, ובכך תומכת בקבלת החלטות ניתנות להרחבה עבור פורטפוליו של פיתוחים ובהמשכיות טרנסלציונלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של יציבות פלסמידים באוכלוסיות מיקרוביאליות מהונדסות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מבנים גנטיים בתנאים ללא סלקציה.
- מספק נתונים ברזולוציה גבוהה להסרת סיכונים מכניסטיים של מעגלים סינתטיים.
- מסייע בביטחון חיזוי בביצועי זנים עבור יישומים המשכיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכין מערכות מיקרוביאליות שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקה בספיקות גבוהות (high-throughput screening).
- מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר ניתוח מקבילי של אלפי מיקרו-מושבות, ובכך מגביר את העוצמה הסטטיסטית.
- תומך בפלטפורמות בדיקה ניתנות להרחבה ולשימוש חוזר עבור מבנים גנטיים מגוונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את יציבות המערכת המיקרוביאלית לאסטרטגיות של סממנים ביולוגיים תרגומיים במידת הרלוונטיות.
- מבטיחה המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות כימותה של השמירה הגנטית.
- מפחיתה את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב חוסר יציבות של הפלסמיד בזנים מהונדסים.
- מספקת תובנות מכניסטיות להפחתת סיכונים חזויה בתהליכי עבודה תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה מיקרופלואידי זה, שהוא במקור פתוח, משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר ניתוחים חסונים של תאים בודדים, החל מאימות מטרות מוקדם דרך פיתוח בדיקות ומחקרי תרגום.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי כימות שימור הפלסמידר ברזולוציה של תא בודד.
- סריקה: מספקת תוצרי בדיקה בעלי שחזוריות ובספיקות גבוהה להערכה אמינה של תרכובות או מבנים גנטיים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה להשוואת יציבות גנטית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי הבטחת נאמנותם של זנים מהונדסים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה ובקוד פתוח, הניתנת להתאמה למערכות גנטיות ומיקרוביאליות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליכי תיקוף של זנים מהונדסים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה והרחבה של ניתוח תאי-בודד באמצעות מכשור נגיש.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go ואת היעילות ההונית על ידי אספקת נתונים חסונים על יציבות גנטית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של פרויקטים של הנדסה מיקרוביאלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנטיקה מיקרובית.
- דורש חומרה בקוד פתוח לבקרה מדויקת על הזרימה והטמפרטורה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לשם אינטגרציה של נתונים הניתנים לשחזור.
- ניתן להתאמה למודלים מיקרוביים ומבנים גנטיים שונים בשינויים מינימליים.
- מוגבל על ידי הצורך בקריאות מבוססות פלואורסצנציה ותשתית דימוג תואמת.
