ניתוח יציבות פלסמיד עם מיקרופלואידיקה טיפתית בקוד פתוח
December 27th, 2024
זרימת עבודה מיקרופלואידית נגישה בקוד פתוח מוצגת לניתוח מקביל של שימור פלסמיד בחיידקים. על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לכמת נוכחות פלסמיד במיקרו-מושבות חד-תאיות בתוך מיקרו-טיפות ג'ל, שיטה זו מספקת אלטרנטיבה מדויקת, נגישה וניתנת להרחבה לספירת צלחות מסורתית.
אנו מפתחים שיטות IC מיקרופיליות בתפוקה גבוהה לחקר מגוון אוכלוסיות התאים ואינטראקציות תא-תא. בהקשר זה, מיקרו-טיפות ג'ל מאפשרות לנו לבצע שלבי פרוטוקול שימושיים, כמו מניפולציה של DNA צביעת ליזה ומיקרוסקופיה בצורה משותקת מאוד בתאים לכודים. זרימות עבודה מיקרופיליות של טיפות ידועות בתפוקה וברבגוניות אולטרה-גבוהות, אך האימוץ מוגבל לרוב על ידי הצורך במכשור מתקדם ומומחיות מיוחדת.
הפרוטוקול שלנו משפר טכניקות מסורתיות באמצעות ניתוח תא בודד בתפוקה גבוהה עם צביעה פלואורסצנטית וזרימת עבודה נגישה של מיקרוסקופיה בקוד פתוח. הוא עוטף תאים במיקרו-טיפות ג'ל באמצעות מיקרופלואידיקה כדי לנתח מיני-תאים ומיקרו-מושבות בו זמנית. בעוד שתרביות בתפזורת וצלחות חסרות ספציפיות ורזולוציה, שיטה זו מספקת סטטיסטיקה מדויקת ומייצגת של תופעות מגוונות.
הפרוטוקולים שלנו משלבים מיקרופלואידיקה טיפתית, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וחומרה בקוד פתוח בשיטה מבוססת תוויות. גישה זו הופכת את ניתוח התא הבודד לגמיש ובמחיר סביר יותר, ומאפשרת לקהילה המדעית לענות על שאלות מדעיות מורכבות הנוגעות לקהילות מיקרוביאליות. כדי להתחיל, יש לחמם אגרוז בטמפרטורת ג'ל נמוכה במיוחד בריכוז של 2% עד 90 מעלות צלזיוס במרק Luria Bertani, או LB.
מנערים את התערובת במשך 10 דקות בשייקר מבוקר טמפרטורה, ואז מורידים את הטמפרטורה של שייקר התרמו ל-39 מעלות צלזיוס כדי לקרר את תמיסת האגרוז. הנח את צינור התרחיף Escherichia coli בשייקר התרמו למשך ארבע דקות כדי לחמם אותו ל-39 מעלות צלזיוס. מערבבים את תרחיף החיידקים ותמיסת האגרוז ביחס של אחד לאחד כדי להשיג ריכוז אגרוז של 1% עם תרחיף תאים של 3.1 כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר.
הכן את תמיסת הבקרה השלילית לניטור זיהום באמצעות תרחיף LB ואגרוז ביחס של אחד לאחד. השג את פלטפורמת הזרימה המלאה בקוד פתוח, כולל דוחפי לחץ גז וחיישני זרימה. כלול מגלשת זכוכית ומחממי קצה פיפטה בהתקנה כדי לשלוט בטמפרטורה של דגימת תא האגרוז כשהיא נכנסת לשבב.
לאחר מכן, מקם את השבב המיקרופלואידי על שלב המיקרוסקופיה המשופרת ב-strobe, וודא שצומת יצירת הטיפות נראה. הגדר את מחמם קצה הפיפטה ומחמם שקופיות הזכוכית ל-40 מעלות צלזיוס באמצעות ממשק תוכנת הבקרה. בעזרת מזרק עם צינור ותקע PDMS, טען את תערובת המתלים של תאי אגרוז 1% לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.
הכנס את הקצה למחמם הקצה והנח אותו על כניסת השלב המימי בשבב המיקרופלואידי. החלף את אטם ה-PDMS של הקצה עם זה המחובר לצינורות מערכת בקרת הזרימה. לאחר מכן, הכנס את צינור השמן לכניסה השנייה ואת קצה צינור היציאה לצינור פסולת.
לאחר מכן הגדר את הלחץ ל-80 מיליבר עבור שלבי ההסכמה והשמן בממשק המשתמש, והתחל בעירוי של תרחיף התא והשמן. כוונן את שלב השמן ל -320 מיליבר ואת שלב ההסכמה ל -180 מיליבר. אפשר דקה אחת לייצוב יצירת הטיפות.
לאחר שייצור הטיפות מתייצב, העבר את צינור היציאה מצינור הפסולת לצינור האיסוף. המשך לאסוף טיפות על קרח עד שמאגר הדגימה יתרוקן. לאחר האיסוף, הניחו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לתת לג'ל האגרוז להיכנס לטיפות.
דגרו על מיקרו-טיפות הג'ל המכילות חיידקים וטיפות הבקרה השליליות ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות או למשך הלילה לצמיחת המושבה. לאחר הדגירה, השתמש במזרק של שלושה מיליליטר עם מחט בגודל 21 כדי להסיר בזהירות כמה שיותר שמן מבסיס תחליב המיקרו-טיפות ג'ל. העבירו 50 מיקרוליטר של מיקרו-טיפות הג'ל למיקרו-צינור חדש, ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס לניתוח טיפות נוסף, הוסיפו תערובת אחד לאחד של שמן מופלר עם PFO בנפח השווה לאמולסיה שנותרה.
לאחר מכן, הוסף כ-200 מיקרוליטר של מאגר נתרן כלורי 0.9% על גבי האמולסיה. מערבל את התערובת, וסובב אותה לזמן קצר בצנטריפוגה במהירות קבועה. הסר בזהירות את שלב השמן מתחתית הממשק הנוזלי והשליך 100 מיקרוליטר תמיסת נתרן כלורי מלמעלה.
העבירו שני מיקרוליטרים של מיקרו-טיפות ג'ל לשקופית תא הדמיה והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של שמן מופלר כדי לסייע ביצירת שכבה אחת של טיפות להדמיה אופטימלית. במיקרוסקופ, הפעל את תאורת מטריצת ה-LED הלבנה מלמעלה להדמיית שדה בהיר. הרכיב את השקופית המוכנה.
התמקד בדגימה כדי לאתר שכבה אחת של טיפות וללכוד תמונת שדה בהיר. לאחר מכן, כוונן את גלגל המסנן כך שיתיישר עם מסנן אורך הגל הירוק. עבור ל-LED של 470 ננומטר לעירור, ומבלי להזיז את הדגימה, צלם תמונה פלואורסצנטית של המושבות.
העבירו שני מיקרוליטרים של המיקרו-ג'לים המוכתמים בפרופידיום יודיד לשבב תא הדמיה והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תמיסת נתרן כלורי 0.9% ליצירת שכבה אחת של מיקרו-ג'לים. אטום את הכניסה והיציאה של השבב כדי למנוע אידוי במהלך ההדמיה. כוונן את מסנן מרווח אורך הגל האדום להדמיית פרופידיום יודיד, וצלם את תמונות השדה הבהיר והפלואורסצנט.
אנקפסולציה של תאים במיקרו-טיפות ג'ל אושרה על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר, המראה טיפות אחידות עם תאים עטופים מובחנים. מושבות שאיבדו פלואורסצנטיות מקודדות פלסמיד זוהו באמצעות ניתוח יחס פלואורסצנטי. מתוך 2,785 מושבות שנותחו, 100 מושבות איבדו את הקרינה, מה שמעיד על שיעור אובדן פלסמיד של 3.6%
סקירה
מחקר זה מציג זרימת עבודה מיקרופלואידית בקוד פתוח לניתוח שמירת פלסמיד בחיידקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השיטה מאפשרת כימות מדויק של נוכחות פלסמיד במיקרו-מושבות חד-תאיות המוקפסלות בטיפות מיקרו-ג'ל, ומציעה אלטרנטיבה להגדלה לשיטות ספירת צלחות מסורתיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה תאית
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- טכניקות מיקרופלואידיות מאפשרות ניתוח בתפוקה גבוהה של אוכלוסיות תאים.
- שיטות מסורתיות לעיתים קרובות חסרות ספציפיות ורזולוציה.
- טיפות מיקרו-ג'ל מספקות פלטפורמה רב-תכליתית לניתוח חד-תאי.
- גישות בקוד פתוח יכולות לדמוקרטיזציה את הגישה למתודולוגיות מתקדמות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה בתפוקה גבוהה לחקר שמירת פלסמיד בחיידקים.
- לשפר את הנגישות והזמינות של טכניקות ניתוח חד-תאי.
- לספק אלטרנטיבה להגדלה לשיטות תרבית מסורתיות.
שיטות ששימשו
- הכנת טיפות מיקרו-ג'ל אגרוז המכילות תאים חיידקיים.
- שימוש במיקרופלואידיקה ליצירת טיפות ומניפולציה שלהן.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לדימות וכימות שמירת פלסמיד.
- ניתוח פלואורסצנטיה של מושבות כדי לקבוע שיעורי אובדן פלסמיד.
תוצאות עיקריות
- אישרה את הקפסולציה של תאים בטיפות מיקרו-ג'ל באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר.
- זיהתה שיעור אובדן פלסמיד של 3.6% בין המושבות שנותחו.
- הוכיחה את יעילות זרימת העבודה בקוד פתוח לניתוח בתפוקה גבוהה.
- סיפקה סטטיסטיקה מדויקת על שמירת פלסמיד באוכלוסיות חיידקיות שונות.
מסקנות
- השיטה שפותחה משפרת את חקר הקהילות המיקרוביאליות.
- היא מציעה גישה גמישה ובמחיר סביר לניתוח חד-תאי.
- זרימת העבודה הזו יכולה להיות מאומצת על ידי חוקרים עם רמות מומחיות שונות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Plasmid stability is a critical parameter in synthetic biology and microbial engineering, directly impacting the reliability of engineered strains in biopharma R&D. High-throughput, quantitative analysis of plasmid retention without antibiotic selection enables robust target validation and de-risks early discovery workflows. Open-source droplet microfluidics democratizes access to advanced single-cell analytics, supporting scalable portfolio decisions and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of plasmid stability in engineered microbial populations.
- Supports functional validation of genetic constructs under selection-free conditions.
- Provides high-resolution data for mechanistic de-risking of synthetic circuits.
- Facilitates predictive confidence in strain performance for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial systems for high-throughput screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Enables parallel analysis of thousands of microcolonies, increasing statistical power.
- Supports scalable and reusable assay platforms for diverse genetic constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial system stability with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by quantifying genetic retention.
- Reduces risk of late-stage failure due to plasmid instability in engineered strains.
- Provides mechanistic insights for predictive de-risking in translational workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This open-source microfluidic workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling robust single-cell analytics from early target validation through assay development and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying plasmid retention at single-cell resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay outputs for reliable compound or construct evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based measurements to compare genetic stability across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring engineered strain fidelity.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to various genetic and microbial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in engineered strain validation.
- Operational Value: Standardizes and scales single-cell analysis with accessible instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic stability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial engineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence microscopy, and microbial genetics.
- Needs open-source hardware for precise flow and temperature control.
- Demands cross-team standardization for reproducible data integration.
- Adaptable to various microbial models and genetic constructs with minimal modification.
- Limited by the need for fluorescence-based readouts and compatible imaging infrastructure.
