Name: הפרדה ופיצול של חלבוני תסנין תרבית (CFPs) מ-Mycobacterium tuberculosis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: חקור הפרדה של חלבוני תסנין תרבית מ-Mycobacterium tuberculosis באמצעות מיקוד איזואלקטרי ו-SDS-PAGE. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבונים אימונוגניים לפיתוח חיסונים ואבחון טוב יותר לשחפת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+a+bioinformatic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach.</a> Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).</li>
<li>de Souza, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+spectrometry+analysis+as+a+tool+to+verify+and+improve+gene+annotation+using+Mycobacterium+tuberculosis+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example.</a> BMC Genomics. 9, 316(2008).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).</li>
<li>Tucci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+proteomic+and+glycoproteomic+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Yasuda, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytokine+profiles+related+to+Mycobacterium+tuberculosis+latent+antigens+using+a+whole-blood+assay+in+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines.</a> Front Immunol. 15, 1330796(2024).</li>
<li>Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+H37Rv+culture+filtrate+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins.</a> Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).</li>
<li>Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+diagnosis+using+immunodominant%2C+secreted+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Mustafa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterization+of+Mycobacterium+tuberculosis-specific+ESAT6-like+proteins+and+their+potentials+in+the+prevention+of+tuberculosis+and+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma.</a> Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).</li>
<li>Rosenkrands, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis.</a> Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).</li>
<li>Jungblut, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteome+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+bovis+BCG+strains%3A+Towards+functional+genomics+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens.</a> Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+proteomic+analysis+of+preparative+isoelectric-focusing+separated+culture+filtrate+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&Auml; מערכת סינון זרימה משיקית שטף KTA&nbsp;</td><td>סיטיבה</td><td>29038437</td><td></td></tr><tr><td>אמפוליטים (pH 3.0 עד 10.0)</td><td>ביו-ראד</td><td>1632094</td><td></td></tr><tr><td>אמפוליטים (pH 4.0 עד 6.0)</td><td>ביו-ראד</td><td>1631143</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת חלבון BCA&nbsp;</td><td>מרק</td><td>71285-מ</td><td></td></tr><tr><td>כמוסות</td><td>מרק</td><td>C2632</td><td></td></tr><tr><td>קזאין הידרוליזט</td><td>מרק</td><td>65072-00-6</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>מרק</td><td>ג0759</td><td></td></tr><tr><td>דיגיטונין</td><td>מרק</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>מרק</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>ברזל אמוניום גופרתי</td><td>היימדיה</td><td>GRM10944</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>מרק</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>מרק</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>לוונשטיין-ג'נסן נוטה&nbsp;</td><td>היימדיה</td><td>SL001</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>מרק</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום לשחרור מהיר של Millipore Stericup</td><td>מרק</td><td>S2HVU11RE</td><td></td></tr><tr><td>חומצה זרחתית&nbsp;</td><td>מרק</td><td>695017</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן אורתופוספט</td><td>מרק</td><td>עמ' 0662</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד&nbsp;</td><td>מרק</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>תא IEF מכין (Rotofor)&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td>170-2986&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד&nbsp;</td><td>מרק</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>נתרן גלוטמט</td><td>מרק</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>היימדיה</td><td>MB095</td><td></td></tr><tr><td>טריס</td><td>מרק</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>מרק</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר ג'ל שלם&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

הפרדה ופיצול של חלבוני תסנין תרבית (cfps) מ-mycobacterium tuberculosis

Separation and Fractionation of Culture Filtrate Proteins (CFPs) from Mycobacterium tuberculosis

איור 1 ממחיש את המורכבות של חלבוני תסנין התרבית (CFP) שהוכנו. בתחילה, 100 מיקרוגרם של CFP עבר ניתוח עמוד 2D-SDS כדי להעריך את מורכבותו. ניתוח זה חשף נוכחות של כמעט 100 נקודות חלבון שונות ב-CFP (איור 1).
20 השברים שנאספו מכל ריצה נותחו על ידי SDS-PAGE. מתוכם, שלושה שברים מייצגים משלוש ריצות שונות מוצגים באיור 2.
איור 3 מתאר את התפלגות ה-pH של השברים...

הפרדה ופיצול של חלבוני תסנין תרבית (CFPs) מ-Mycobacterium tuberculosis

Secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) play a crucial role in tuberculosis pathogenesis, immune modulation, and disease ...

separation-fractionation-culture-filtrate-proteins-cfps-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: גופטה, ס., מרסלה רודריגז, ג. בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הבידוד ההדרגתי של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Mycobacterium tuberculosis שגודלו בתנאים מגבילים של ברזל המחקים את הסביבה המארחת. הוא מתאר את השימוש באולטרה-סינון, צנטריפוגה דיפרנציאלית והפרדת שיפוע צפיפות כדי להעשיר ולזהות שברים המכילים EV.

בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות המכילות סידרופור מ-Mycobacterium tuberculosis

סרטון זה מדגים את ההפרדה מבוססת הכרומטוגרפיה הדקה של חומצות מיקוליות. שיטה זו מפרידה את החומצות המיקוליות השונות – ליפידים ארוכי שרשרת הנמצאים בדופן התא של מיקובקטריה – בהתבסס על הקוטביות שלהם.

הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה של גרסאות חומצה מיקולית: שיטה להפרדת שומנים בדופן התא המיקובקטריאלי על בסיס קוטביות

סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של חלבוני סינון תרבית חיידקים, הכוללים שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות, באמצעות אולטרה-סינון. השלפוחיות החוץ תאיות המרוכזות משמשות כסמנים אבחוניים לגילוי מחלות.

תרבית חיידקים מסננת ריכוז חלבונים באמצעות מכשיר אולטרה-סינון

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (EVs) מסנין התרבית של Mycobacterium tuberculosis (Mtb). הטכניקה משתמשת בעמוד שרף נקבובי כדי להשיג שברים מטוהרים של כלי רכב חשמליים. החלקיקים הנקבוביים מאפשרים באופן סלקטיבי לחלבונים קטנים יותר להיכנס לנקבוביות, וכתוצאה מכך ההדבקה איטית יותר. במקביל, כלי רכב חשמליים אינם נכנסים לנקבוביות בשל גודלם הגדול יותר והם מדוללים ראשונים.

טכניקת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל לטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות

המטרה היא לאנגיופלסטיקה ולבודד אקטיביים מולקולות קטנות, פפטידים מתוך תמצית צמח מורכב, חלבונים של חיידקים פתוגניים על ידי שימוש בשיטת מיקוד בשלב נוזלי (הארה ב) שיטה. יתרה מזאת, המולקולות המופרדות זוהו ופעילותם הביוביולוגית אושרה.

הפרדת מולקולות ביו-אקטיביות קטנות, פפטידים ממקורות טבעיים וחלבונים מחיידקים על ידי שיטת התמקדות איזואלקטריים

כימות מהיר ויעיל של גדילת שחפת M. תוך תאית הוא חיוני להמשך טיפולים משופרים נגד שחפת ( שחפת ). פרוטוקול זה מתאר בדיקת זיהוי קולורימטרית מבוססת מרק באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית כדי לכמת את גידול ה-Mtb במקרופאגים שטופלו בטיפולים מוכווני מארח מועמדים.

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

כאן, אנו מדגימים את ההכנה של תסנין תרבית Mtb (CF), שהוא מצע הגידול החיידקי המורכב מחלבונים המופרשים על ידי החיידקים. Mtb מפריש חלבונים כדי לווסת את איתות המארח ואת התגובה החיסונית, החיוניים לפתוגנזה. ה-CFs שהוכנו מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את כל גורמי ההפרשה.

הכנת תסנין תרבית Mycobacterium tuberculosis להבנת פתוגנזה של שחפת

פרוטוקול זה מפריד בין חלבוני דופן התא והממברנה הבלתי מסיסים לשברים פשוטים (1-5 חלבונים) באמצעות מיקוד איזואלקטרי מכין (IEF) המבוסס על נקודה איזואלקטרית, ואחריו הפרדה לפי משקל מולקולרי. ניתן להשתמש בשברים המתקבלים ישירות לניתוח אימונולוגי ופרוטאומי ללא טיהור נוסף.

הפרדה ופיצול של חלבוני דופן התא וקרום התא מ-Mycobacterium tuberculosis לניתוח חלבונים במורד הזרם

חקור הפרדה של חלבוני תסנין תרבית מ-Mycobacterium tuberculosis באמצעות מיקוד איזואלקטרי ו-SDS-PAGE. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבונים אימונוגניים לפיתוח חיסונים ואבחון טוב יותר לשחפת.

הפרדה ופיצול של חלבוני תסנין תרבית (CFPs) מ-Mycobacterium tuberculosis

גלה סרטונים נוספים