הפרדה ופיצול של חלבוני דופן התא וקרום התא מ-Mycobacterium tuberculosis לניתוח חלבונים במורד הזרם

המחקר שלנו התמקד בפיתוח שיטה יעילה להפרדת חלבוני דופן התא וקרום התא הבלתי מסיסים של Mycobacterium tuberculosis לשברים פשוטים לבדיקות פרוטאומיות ואימונולוגיות ישירות. ההתקדמות בטכניקות האלקטרופורטיות מאפשרת כעת להפריד חלבונים מורכבים לפחות שברי חלבון, מה שמקל על בידוד יעיל מבוסס מפרט מסה ליישומים פרוטאומיים ואימונולוגיים פונקציונליים. האתגרים העיקריים כוללים מסיסות ירודה של חלבון הידרופובי המשקע מעל מאה מיליגרם ודנטורציה המושרה על ידי SDS-PAGE, מה שמעכב יישום במורד הזרם הזקוק לאישור מקורי כמו מבחני פעילות אנזימים.

אף פרוטוקול נוכחי אינו מפריד באופן שיטתי בין חלבוני דופן התא ההידרופוביים הבלתי מסיסים וחלבוני קרום התא לשברים מוגדרים מסיסים במים לניתוח פרוטאומי ואימונולוגי ישיר, שהוא המפתח להבנת התפקוד והנחיית התערבויות. המחקר העתידי שלנו יתמקד בפיתוח אבחון מבוסס אנטיגן של תאי T ולהעריך את הרגישות, הספציפיות והביצועים שלהם בקרב אוכלוסיית השחפת לגילוי מוקדם ומדויק של שחפת במטרה לתמוך בשליטה טובה יותר במחלה. כדי להתחיל, השג את דופן התא, קרום התא ודגימות חלבון ציטוזולי מליזאט תאים שלמים של חיידקי Mycobacterium tuberculosis.

מסיס את חלבוני דופן התא וקרום התא במאגר מיקוד איזואלקטרי. הוסף 2% אמפוליט בין טווחי pH של 3 עד 10 ו-4 עד 6 ביחס של אחד לארבע. כעת חלקו את החלבונים המסיסים במערכת מיקוד איזואלקטרית נוזלית הנשמרת בארבע מעלות צלזיוס עם אמבט מים לקירור.

בצע הפרדה איזואלקטרית ממוקדת בהתאם להוראות היצרן על ידי הפעלת הספק קבוע של 12 וואט. אסוף את השברים הבודדים עם מיקוד איזואלקטרי בעזרת משאבת ואקום. קבע את ערכי ה-pH של כל שבר.

הכניסו 50 מיקרוגרם מהשברים המופרדים ל-SDS-PAGE והדמיינו את החלבונים באמצעות צביעה כחולה מבריקה או כסף של Coomassie. התחל בערבוב דופן התא המופרד על ידי IEF ושברי קרום התא עם מאגר דגימת אלקטרופורזה של ג'ל SDS. מחממים את התערובת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הפרד את שברי החלבון בממד השני, באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד בגודל 16 על 20 סנטימטר עם ג'ל מפרק 12.5% וג'ל ערימה של 4%. לאחר מכן השתמש בבאר דגימה בודדת באורך 13 ס"מ כדי להעמיס את הדגימה על הג'ל. בצע אלקטרופורזה בזרם קבוע של 50 מיליאמפר לג'ל עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.

לאחר אלקטרופורזה, יש לאזן את הג'ל במאגר פליטה למשך 10 דקות. מעבירים את הג'ל למנגנון שלם של אלוטר ג'ל לפי הוראות יצרן המכשיר. הפעל את האלוטר בזרם קבוע של 250 מיליאמפר למשך שעה אחת כדי להוציא את החלבונים מהג'ל, ולאחר מכן השתמש במשאבת ואקום כדי לאסוף כ-30 שברי חלבון, כל אחד בגודל שלושה מיליליטר, מהג'ל.

כמת את ריכוז החלבון בשברים המנופחים באמצעות בדיקת חלבון החומצה הביסינצ'ונינית. הכניסו 10 מיקרוגרם של שברי החלבון שנפלטו לניתוח SDS-PAGE והדמיינו את הרצועות על ידי צביעה כחולה מבריקה של Coomassie. דפוסי רצועות חלבון מובהקים נצפו בסופרנטנט הראשון: דופן התא, קרום התא ושברי ציטוזול של Mycobacterium tuberculosis, המאשרים פיצול תת-תאי מוצלח.

המיקוד האיזואלקטרי של חלבוני דופן התא הראה את ריכוז החלבון הגבוה ביותר בשברים עם pH מתחת ל-2.5. SDS-PAGE של שברי IEF בדופן התא חשפו רצועות חלבון מובהקות, בעיקר בשברים 1 עד 8. הפרדת חלבון קרום התא על ידי IEF חשפה שיאי ריכוז חלבון עיקריים בין pH 4 ל-pH 10, כאשר הריכוז הגבוה ביותר מתרחש סביב pH 10.

SDS-PAGE של שברי IEF של קרום התא הראו פרופילי חלבון מגוונים עם רצועות ברורות יותר בשברים 1 עד 9. הפרדת SDS-PAGE הכנה של חלבוני דופן התא שנפתרו על ידי IEF ייצרה שברים בעיקר מתחת ל-100 מיקרוגרם למיליליטר. SDS-PAGE של שברי חלבון דופן התא המנופחים הציג מגוון רחב של משקלים מולקולריים של חלבון, עם רצועות מרוכזות יותר בשברים 6 עד 10.

SDS-PAGE מכין של שברי חלבון קרום התא גילה שלמעלה ממחצית מהשברים היו ריכוזי חלבון בין 50 ל-199 מיקרוגרם למיליליטר. SDS-PAGE של שברי חלבון קרום התא המנופחים חשף רצועות מרוכזות בנתיבים 1 עד 8 ו-13 עד 16.