קביעת ארבעה רכיבים במערכת אספקת RNA של ננו-חלקיקי שומנים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב גלאי פיזור אור אידוי

המחקר שלנו מתמקד ביישום ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה בתחום חומצת גרעין, חלבון פפטיד ו-CDT. האתגר של ניסוי זה טמון בהפרדה של רכיבים מרובים של LNPs וקביעת רכיבים עם ריכוזים שונים משמעותיים ובעיות שיוריות. היתרון של פרוטוקול זה הוא בכך שהוא משיג הפרדה טובה, תחום ליניארי רחב וקביעת זרם של LNPs בעלות נמוכה.

כדי להתחיל, הגדר כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, או מערכת HPLC, יחד עם גלאי פיזור אור אידוי. התקן את העמודה הכרומטוגרפית בהתאם לכיוון החץ בעמודה. חבר קצה אחד לשקע הדגימה האוטומטית, ואת הקצה השני לכניסת גלאי פיזור האור באידוי.

להכנת שלב א', יש למדוד ולהעביר במדויק 1,387 מיקרוליטר טריאתילאמין ולהמיס אותו ב -1000 מיליליטר מים. מערבבים היטב ומתאימים את ה-pH לשבע באמצעות חומצה אצטית. להכנת שלב ב', ממיסים 1,387 מיקרוליטר טריאתילאמין ב-1000 מיליליטר מתנול.

מערבבים היטב ומתאימים את ה-pH לשבע עם חומצה אצטית. מניחים את שלב A ושלב B במגש. הפעל את תוכנת LabSolutions ופתח את חלון הניתוח בזמן אמת.

לחץ על קובץ ובחר חדש כדי ליצור קובץ שיטה חדש, שנה את זמן העצירה של הכרומטוגרפיה הנוזלית ל-15 דקות ולחץ החל על כל זמן הרכישה. לאחר מכן לחץ על משאבה ושנה את פרמטרי המשאבה. בחר את מצב הניתוח כשיפוע לחץ גבוה בינארי, או BGE, והגדר את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה.

הגדר את ריכוז המשאבה הראשוני B ל-80%שנה את שיפוע הפאזה הנייד בשלוש דקות ל-80%בארבע דקות ל-85%מ-5.5 ל-12 דקות ב-100%ולאחר 12.1 דקות, תן להחזיר את המשאבה ל-80%עכשיו לחץ על תנור עמודות והגדר את טמפרטורת התנור ל-55 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לחץ על ELSD כדי לשנות את טמפרטורת צינור הסחיפה ל-40 מעלות צלזיוס ולשמור את השיטה. לחץ על הורד והפעל כדי להפעיל ולאזן את המכשיר.

שקלו במדויק 10 מיליגרם מכל אחד מארבעת החומרים הסטנדרטיים של רכיב ננו-חלקיקי השומנים בנפרד. ממיסים כל אחד במיליליטר אחד של מתנול ומערבולת עד להמסה מלאה לקבלת תמיסות מלאי בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר לכל רכיב. בעזרת פיפטה, העבירו במדויק 100 מיקרוליטר מכל תמיסת מלאי לבקבוקון דגימה.

מוסיפים 600 מיקרוליטר מתנול ומערבבים היטב להכנת תמיסת ביניים מעורבת, כזו בריכוז של 1000 מיקרוגרם למיליליטר. כעת, העבירו במדויק 20 מיקרוליטר מכל תמיסת מלאי לבקבוקון דגימה. מוסיפים 920 מיקרוליטר מתנול ומערבבים היטב להכנת תמיסת ביניים מעורבת, שתיים בריכוז של 200 מיקרוגרם למיליליטר.

הכינו סדרה של תמיסות סטנדרטיות בריכוזים שונים על ידי דילול סדרתי. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, העבירו במדויק 100 מיקרוליטר מהדגימה לבקבוקון דגימה. לאחר מכן מוסיפים 900 מיקרוליטר מתנול ומערבבים היטב כדי להבטיח דילול פי עשרה של ננו-חלקיקי שומנים ודיסוציאציה שלהם מתרופת חומצת הגרעין.

הנח את התמיסות הסטנדרטיות ותמיסות הדגימה לתוך הדגימה האוטומטית של הכרומטוגרף הנוזלי. לחץ על אצווה בזמן אמת בסרגל הכלים של המסייע של חלון הניתוח בזמן אמת. לאחר מכן, לחץ על חדש בתפריט קובץ כדי ליצור טבלת אצווה חדשה.

בטבלת האצווה, הזן את מספר הבקבוקון, שם המגש, קובץ הנתונים ונפח ההזרקה של הפתרונות הסטנדרטיים והמדגמים. בחרו בקובץ השיטה שנשמר ולחצו על 'שמור קובץ אצווה' בתפריט 'קובץ'. המתן עד שלחץ הכרומטוגרף הנוזלי וקו הבסיס של הכרומטוגרמה יהיו יציבים.

לאחר מכן לחץ על התחל אצווה בזמן אמת בסרגל הכלים של העוזר כדי להתחיל ברכישת נתונים. לניתוח נתונים, פתח את חלון הדפדפן של תוכנת LabSolutions. גרור את נתוני הפתרון הסטנדרטיים לתצוגת התוצאות הכמותיות כדי ליצור עקומת כיול.

שנה את פרמטרי עיבוד הנתונים על ידי לחיצה על ערוך בתצוגת השיטה. בחלון פרמטרי האינטגרציה, שנה את אלגוריתם האינטגרציה ל-I-PeakFinder והגדר את סוג הבסיס לבסיס לבסיס. לאחר מכן, בפרמטרי הזיהוי, שנה את שיטת הזיהוי לפס והגדר את רוחב הפס המוגדר כברירת מחדל ל-0.1 דקות.

כדי לשנות את הפרמטרים הכמותיים, שנה את השיטה הכמותית לסטנדרט חיצוני. הגדר את מספר רמות הכיול לשבע. לאחר מכן בחר את סוג עקומת הכיול כאקספוננציאלית ושנה את הגדרות התרכובת.

הזן את השמות וריכוזי התמיסה הסטנדרטיים של ארבעת רכיבי ננו-חלקיקי השומן. לחץ פעמיים על קודקוד השיא כדי לעדכן את זמני השמירה. לחץ על תצוגה כדי להשלים את השינוי של פרמטרי עיבוד הנתונים.

כעת, שנה את סוג המדגם בתצוגת התוצאות הכמותיות לנקודת חישוב סטנדרטית. הגדר את רמות התמיסה הסטנדרטית מאחת לשבע בהתאם לריכוזים. לאחר קביעת עקומות הכיול, לחץ על קובץ בשורת התפריטים ושמור את קובץ השיטה.

גרור את הנתונים לדוגמה לתצוגת התוצאות הכמותיות של חלון הדפדפן. התבונן בתוצאות הריכוז המוצגות של ארבעת רכיבי ננו-חלקיקי השומנים בדגימות. ניתוח התמיסה הסטנדרטית של LNP השיג הפרדה בסיסית עם דרגת הפרדה גדולה מ-1.5 עבור ארבעת הרכיבים, ולא נצפו שאריות בתמיסות סטנדרטיות בריכוז גבוה.

עקומת הכיול עבור ארבעת הרכיבים הציגה מקדמי מתאם העולים על 0.999 בטווח הריכוזים של חמישה עד 250 מיקרוגרם למיליליטר, מה שמעיד על ליניאריות מצוינת. השיטה הראתה יכולת שחזור גבוהה, עם סטיית תקן יחסית לזמן שמירה של פחות מ-0.1% וסטיית תקן יחסית לאזור השיא של פחות מ-2% בהתבסס על שש הזרקות חוזרות של 10 מיקרוגרם לתמיסה סטנדרטית של מיליליטר. הניתוח של דגימות LNP אמיתיות מדוללות 10 פעמים עם מתנול הראה ריכוזי רכיבים הנעים בין 150 מיקרוגרם למיליליטר ל-1,500 מיקרוגרם למיליליטר, והשגת הפרדה ורגישות גבוהות באופן עקבי בין מספר יצרנים.